高度に保存されたエンテロウイルスの 5' クローバー葉 RNA 複製要素の結晶構造

Nature Communications volume 14、記事番号: 1955 (2023) この記事を引用

2622 アクセス

17 オルトメトリック

メトリクスの詳細

エンテロウイルス RNA ゲノムの最も端の 5' 末端には、ゲノム複製の開始に必要な 3CD および PCBP タンパク質を動員する、保存されたクローバーの葉状ドメインが含まれています。 今回我々は、抗体シャペロンと複合体を形成したCVB3ゲノムに由来するこのドメインの結晶構造を1.9Åの分解能で報告する。 RNAは、同軸に積み重ねられたsA-sDおよびsB-sCヘリックスを有する4つのサブドメインを含む逆平行H型四方向接合部に折り畳まれます。 sC ループ内の保存された A40 と sD サブドメイン内の Py-Py ヘリックスの間の長距離相互作用により、sA-sB および sC-sD ヘリックスのほぼ平行な配向が組織されます。 私たちの NMR 研究では、これらの長距離相互作用が溶液中でシャペロンなしで起こることが確認されました。 系統発生解析により、我々の結晶構造が、A40 と Py-Py 相互作用を含むエンテロウイルスのクローバー葉様ドメインの保存された構造を表すことが示されました。 タンパク質結合研究はさらに、H 字型構造がウイルス複製のために 3CD と PCBP2 を動員するための既製のプラットフォームを提供することを示唆しています。

ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属には、風邪、灰白髄炎、急性弛緩性麻痺、心筋炎など、多くのヒトの病気の原因となる多数の病原性ウイルスが含まれています1、2、3。 これらのウイルスは、約 7,500 ヌクレオチド (nt) の (+) センス一本鎖 RNA ゲノムを含み、3 ' 末端がポリアデニル化され、5 ' 末端でウイルスタンパク質 VPg と共有結合しています (図 1a)4。 、5、6、7。 ゲノム全体は、高度に保存された 5' および 3' 非翻訳領域 (UTR) に隣接した単一のオープン リーディング フレーム (ORF) で構成されています。 約750ntの5'-UTRには、宿主細胞内でのウイルスゲノムの翻訳と複製に必須のモジュール式RNAドメインが含まれています（補足図1）。 ORF のすぐ上流に位置する 90 位から 750 位の 5'-UTR の約 660 nt は、キャップ非依存性機構を通じてウイルスゲノム翻訳を促進する内部リボソーム侵入部位 (IRES) に寄与しています 8、9、10、11。 エンテロウイルスゲノムの5'端の残りの90ntは複製に必須であり、必要なウイルス因子と細胞タンパク質因子を統合するためのプラットフォームとして機能するクローバーの葉のようなRNA二次構造（5'CL）を採用すると提案されている。ウイルスゲノム複製の開始に使用されます8、12、13、14、15。 今回我々は、エンテロウイルス B 種のメンバーであるコクサッキーウイルス B3 (CVB3) に由来する、無傷のエンテロウイルス クローバー葉 RNA の高解像度の結晶構造を報告します。

a 5'CLの位置と、ウイルス3CDおよび宿主PCBPタンパク質の推定結合部位を含むその提案された二次構造を示すエンテロウイルスゲノムの概略図。 b 以前の生化学分析に基づくCVB3 5'CL2a結晶化コンストラクトの二次構造。Fab BL3-6結合エピトープ5'-GAAACAC-3'モチーフがサブドメインsBのL2ループを置き換えます。 灰色で着色されたヌクレオチドは、野生型配列と比較した突然変異または挿入を表します。 c CVB3 5'CL2a の結晶構造は Fab BL3-6 と共結晶化し、1.9 Å の分解能で解析されました。 分かりやすくするために、RNA 構造の回転図では Fab が隠されています。 図のパネルと対応するラベルは、比較しやすいように同様に色付けされています。

5'CL はエンテロウイルス属のすべてのメンバー間で高度に保存されています。 エンテロウイルスの 5'CL 間の構造的特徴が高度に保存されているため、5'CL が交換されたキメラ エンテロウイルス ゲノムは生存可能なウイルス粒子を生成することが示されています 16、17、18。 提案された RNA の二次構造は、sA、sB、sC、および sD と呼ばれる 4 つの高度に組織化されたサブドメインで構成されています (図 1a)。 サブドメイン sA はクローバーの葉の基幹を形成しますが、サブドメイン sB、sC、および sD はそれぞれ折り畳まれて別個のステム ループ構造になります。 サブドメイン sD は、sD ループと 3C プロテアーゼとの特異的相互作用を通じて、ウイルス融合タンパク質 3CD (ウイルス プロテアーゼ 3C およびウイルス RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ (RdRp) D の前駆体) を動員します 17、19、20、21。 ループ内に C リッチな配列を持つサブドメイン sB は、宿主のポリ (C) 結合タンパク質 (PCBP) を動員し、3 つのタンパク質と複合体を形成したポリ (A) 結合タンパク質 (PABP) との相互作用を通じてウイルスゲノムの環状化を促進します。 '末端ポリ(A)テール19,22,23,24,25,26,27,28,29。 ウイルスゲノムの 2C コード領域内のステムループ RNA ドメイン cre も 3CD30,31,32 と相互作用し、ウイルス VPg タンパク質のウリジル化を促進します 31,33。その後、(-) のプライマーとして機能します。 RdRp D30,34による鎖RNA合成。 さらに、5'CLの配列と構造の完全性もVPgのウリジル化とゲノムの安定性に影響を与えることが示されており、エンテロウイルスの5'CL内のRNA構造的特徴の複数の重要な役割が強調されています14,35。 激しい選択圧力にもかかわらず、エンテロウイルスゲノムにおける5’CLの高度な保存は、ウイルスゲノム中のウイルス由来および宿主タンパク質との相互作用のために5’CLの一次、二次、および三次RNA構造を保存するというウイルスの要件も強調しています。レプリケーション。 しかし、我々は無傷のエンテロウイルス 5'CL の高解像度の三次元構造を欠いており、エンテロウイルス感染症に対する標的治療薬を開発するための多大な可能性を秘めたこの基本的なウイルス学的プロセスの理解に制約を与えています。

エンテロウイルスの 5'CL サブドメインの構造と、PCBP および 3C または 3CD タンパク質との分子相互作用を研究するために、いくつかの生化学的および生物物理学的方法が使用されています 36、37、38、39、40、41、42、43、44。 以前の研究は、核磁気共鳴（NMR）分光法を使用して単離されたsD構造を理解することに焦点を当てており、これにはCVB3、ライノウイルスB14（RVB14）、およびエンテロウイルスコンセンサス配列のsDサブドメインのNMRに基づく構造が含まれていました36、37、38、40、43。 全長 5'CL または 5'-UTR 全体 39,42,45 に関連した化学的プローブおよび SHAPE (プライマー伸長によって分析される選択的 2' ヒドロキシル アシル化) 分析と一致して、NMR 構造はよく保存されていることを示しました。 sD バリアントの構造は、テトラループで覆われた A 型螺旋ステムを備えたヘアピン状の構造を採用しています。 興味深いことに、この構造により、sD ステム内の独特なピリミジン-ピリミジン (Py-Py) 塩基対領域も明らかになりました。これは、以前に 3 × 3 塩基の対称バルジを形成すると予測されていました。 この領域の配列と構造はすべてのエンテロウイルス間でよく保存されており、CVB3 について以前に示したように、この領域ではヌクレオチドの欠失ではあるが、代償的な点突然変異ではなく、3C プロテアーゼとの sD 相互作用が減少することが示唆されています。 Py-Py 領域内に形成される構造的特徴の完全性は、3C 結合にとって重要です 14,20。 しかし、NMR データは、この領域と 3C プロテアーゼ間の直接的な相互作用を裏付けませんでした。 タンパク質との直接相互作用には、sD ループ ヌクレオチドと Py-Py 領域に隣接する 2 つの GC 塩基対のみが関与していました 38。 その後、ウォーデンら。 らは、RVB14 から単離された 24 塩基の sB 配列の NMR 構造を報告しました。この配列は、無秩序な 8 塩基ループで覆われた主に A 型のらせんステムを備えたヘアピン状に折り畳まれています 41。 以前の生化学的研究と一致して、宿主 PCPB の認識部位であるループ内の C に富む領域が溶媒にさらされていました 41。 ステム領域にはアクセス可能な主溝があり、タンパク質相互作用の可能性のある部位を示しています。 ごく最近では、ウォーデンら。 らは、NMR および小角 X 線散乱 (SAXS) 技術を使用して、全長 RVB14 5'CL の構造モデルを導き出しました 43。 提案された構造モデルは、溶液中の Mg2+ の有無に応じて 2 つの立体構造を採用しました。 Mg2+ の非存在下では、5'CL は sB サブドメインと sD サブドメインが互いにほぼ直角に存在する cK 型四方結合構造に似た拡張立体配座をとりましたが、Mg2+ の存在下ではよりコンパクトな立体配座をとりました。これらのsBおよびsDサブドメインを並置する立体構造43。 それにもかかわらず、他のサブドメイン (sA および sC) および無傷の 5'CL の高解像度構造がなければ、5'CL サブドメインのトポロジカルな配置や、ウイルスの 3C、3CD、および宿主との結合相互作用を促進する構造的特徴がわかりません。 PCPB タンパク質は依然としてほとんど知られていません。

ここでは、合成抗体フラグメント (Fab) をシャペロンとして使用し、CVB3 の全長 5'CL の結晶構造を 1.9 Å 分解能で決定します。 RNA は、ジャンクション内に不対ヌクレオチドを持たない H 型四方向ジャンクション構造に折り畳まれます。 サブドメインは 2 セットの同軸上に積み重ねられたヘリックスに集合し、各同軸上に積み重なることでほぼ連続した A 型ヘリックスが形成されます。 四方向接合部内では、sA ヘリックスは sD ヘリックスの上に積み重なり、sB ヘリックスは sC ヘリックスの上に積み重なります。 結晶由来の二次構造は、生化学的プローブ、SHAPE、およびさまざまな 5' CL から単離されたサブドメインの NMR 研究から以前に得られた二次構造とよく一致します。 驚くべきことに、我々の結晶構造は、高度に保存されたsBループとsDヘリックスPy-Py領域の間に前例のない三次相互作用を明らかにした。 これらの相互作用は溶液 NMR の結果とよく一致しており、結晶構造で観察された構造的特徴が溶液での構造的特徴を表していることを示しています。 これらの構造的特徴の独特な配置は、これらの構造的特徴が、3C または 3CD および PCBP タンパク質と相互作用するためにその sB および sD サブドメインを完全に配置する 5'CL の全体構造を安定化するのに重要であることも示唆しており、これは組換え CVB3 を使用した我々の結合研究と一致します。等温滴定熱量測定 (ITC) とゲル電気泳動を使用した 3C プロテアーゼとヒト PCBP2。 エンテロウイルスからの無傷の5’CLの高分解能構造決定は、エンテロウイルスゲノム複製中の5’CLの構造組織と機能的役割を理解する取り組みを促進します。 さらに、エンテロウイルス間で 5’CL の配列と二次構造が高度に保存されていることを考慮すると、この研究は 5’CL を介したエンテロウイルス複製機構の理解に役立ち、ウイルス複製阻害の標的治療薬の開発に大きな可能性を秘めています。エンテロウイルス感染によって引き起こされる多くのヒトの病気をより効果的に治療するために。

CVB3 5'-UTR には、高度に組織化された RNA 二次構造を含む 7 つのモジュールドメインが含まれています (補足図 1)39。 II から VII と指定されたドメインには、キャップ非依存性機構を介したウイルスゲノム翻訳を担う IRES エレメントが含まれており、ドメイン I は 5' CL 構造を表します 8、9、10、11、12、13、14、15。 CVB3 単離株 28 からの 90 nt 野生型 (WT) 結晶化コンストラクトは、sA ヘリックスの先頭に 2 つの追加の GC ペアを含む 5'CL 全体 (nts 2 ～ 88) を含みます (補足図 2)。 この WT 5'CL 構築物を結晶化する我々の努力は失敗に終わりました。 したがって、我々はシャペロン支援による RNA 結晶化戦略に従いました。 我々は、Fab-RNA複合体結晶化のシャペロンとして、また構造決定プロセス中の初期段階の分子置換モデルとして、Fabフラグメントを開発および使用してきました46、47、48、49、50、51。 この戦略におけるアプローチの 1 つは Fab-エピトープ モジュールを利用しており、これには RNA エピトープを標的 RNA に移植して Fab との複合体形成を可能にし、その後の Fab-RNA 複合体の結晶化が可能になります46、47、48、49、50。 ,51。 とりわけ、Fab BL3-6 は、いくつかの RNA 標的の結晶化と高分解能結晶構造の決定に非常に効果的なシャペロンです 46、47、49、50、52、53。 Fab は、好ましくは GC ペアによって閉じられた 5'-AAACA-3' ペンタループ配列を持つヘアピン RNA に結合し、これにより、標的 RNA へのエピトープ配列の容易な操作が可能になります 46、47、49、50、52、53。

インタクトな 5'CL およびその単離ドメインに関する生化学的プローブ、SHAPE、および NMR 研究から得られた 5'CL の推定二次構造に基づいて、3 つの別個の RNA 構築物、5'CL2、5'CL3、および 5'CL4 を調製しました。 、WT 5'CLのL2、L3、およびL4ループを5'-GAAACAC-3'配列に置き換えて各RNA構築物にFab BL3-6の結合部位を作成することによる結晶化用（補足図2） 。 天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動アッセイにより、Fab BL3-6 がこれら 3 つの RNA 構築物に明示的に結合することが確認され（補足図 3）、この Fab BL3-6 結合配列がグラフトされた他の RNA 構築物に関する以前の報告と一致しています。 Fab BL3-6 はヘアピン RNA としてのみそのエピトープ配列に結合するため、これらの観察は、以前の生化学および NMR 研究と一致して、各 5'CL サブドメイン、sB、sC、および sD が異なるステムループ構造をとる可能性が高いことも示しました。

結合テストに続いて、Fab BL3-6 と複合体を形成した 3 つの RNA 構築物、5'CL2、5'CL3、および 5'CL4 のすべてについて結晶化トライアルを設定しました。 5'CL2および5'CL4複合体の結晶は観察されましたが、5'CL3複合体では観察されませんでした。 各複合体についてスクリーニングされた 480 の条件のうち、5'CL2 複合体は 5'CL4 (16) よりも少ない条件 (2) で結晶化しました。 Fab BL3-6を含まない両方の構築物に対する同様の試験では結晶は生成されず、5'CL2および5'CL4結晶化の促進におけるFabの実質的な役割が示唆された。 残念ながら、これらの複合体の結晶は約 8 Å の分解能までしか回折せず、高分解能の構造決定には不十分でした。 より高品質の結晶と高解像度の回折データセットを取得するために、いくつかの 5'CL2 変異体コンストラクトを調製して、Fab BL3-6 と複合体での結晶化トライアルを設定しました。 各 L2 ループ変異体について、特に L2 テトラループ立体構造に注目して、ROSIE54,55 を使用して sD ヘアピン モデルを予測しました。 モデルは、G66C 変異体が野生型 L2 の UNCG 型テトラループと比較して GNRA 型テトラループ構造を採用すると予測します (補足図 4)。 GNRA 型テトラループは結晶接触を促進することが知られているため 56、この G66C 変異を 5'CL2a と呼ばれる 5'CL2 に関連して使用しました (図 1b)。これにより、1.9 まで回折する Fab と複合体を形成した堅牢な結晶が得られました。 Åの解像度。 このデータを用いたその後の構造解析プロセスでは、分子置換モデルとして以前の Fab BL3-6 (PDB コード: 6B14)46 の結晶構造を使用し、初期相を容易に取得しました。 最初のフェーズの後、高解像度の電子密度マップにより、RNA ヌクレオチドを明確にモデル化することができました。 その後、1.9 Å の分解能でモデルの再構築と改良を繰り返すことで構造が解析され、5'CL2a-BL3-6 複合体の最終モデルは Rwork = 20.9%、Rfree = 25.9% に収束しました。 データ収集と精製統計の詳細を補足表 1に示します。 2|Fo | との5'CL2a-BL3-6複合体の最終構造モデル。 -|FC | 電子密度マップと結晶学的B因子に従って色付けされた電子密度マップを補足図に示します。 それぞれ5と6。

格子空間群 C 1 2 1 を持つ結晶学的非対称単位 (a = 122.20、b = 48.70、c = 144.65、ɑ = 90、β = 112.92、および γ = 90) には、単一の Fab-RNA 複合体が含まれています。 PDBePISA57を使用した単位格子内の界面面積の分析により、Fab-RNA結合界面を含めて、Fab-Fab、Fab-RNA、RNA-RNA結晶接触面積がそれぞれ約142、2993、266Å2であることが明らかになりました。 Fabは結晶接触の大部分（Fab-RNA結合界面を含む〜92％）を形成しますが、結晶格子内の対称関連sAヘリックスの同軸スタッキングを介したRNA-RNA相互作用（補足図7）は〜8％を占めます。界面領域の。 結合界面以外の結晶格子における Fab-RNA の接触には、主に静電相互作用が関与します。

対称関連Fabの重鎖および軽鎖からのリジンおよびアルギニン側鎖を持つRNA骨格。これは、FabがRNA表面の負電荷を中和することによって結晶のパッキングを促進したことを示しています（詳細については補足図8を参照）。

90ヌクレオチドの5'CL2a構築物の結晶構造は、1つのステム領域と3つのステムループ領域で構成されるコンパクトなH型逆平行四方向接合構造を想定しています（図1c）。 P1、P2、P3、および P4 で指定される 4 方向接合部を構成する 4 つのらせん状ステムは、同軸に積み重ねられた 2 セットのらせんに集合し、P1 は P4 に積み重ねられ、P2 は P3 に積み重ねられます。 四方向接合部内では、不対ヌクレオチドがなく、P1 ヘリックス G10 と P4 ヘリックス G47、および P2 ヘリックス C11 と P3 ヘリックス C46 の完全な交差鎖スタッキングがあり、これらの同軸スタッキングの各セットは、ほぼ連続した A 型ヘリックスを形成します。 予想どおり、L2 ループは P2 ヘリックスを閉じて Fab BL3-6 に結合します。これは、他の RNA-BL3-6 複合結晶構造で観察される Fab ループ相互作用と一致しています 46、47、49、50、52、53。 同様に、トリヌクレオチド ループ L3 とテトラヌクレオチド ループ L4 は、それぞれ P3 ヘリックスと P4 ヘリックスを閉じます。 U49とA50によるジヌクレオチドのバルジは、ヘリックスP4をサブヘリックスP4aとP4bに分離し、U49は連続したヘリックススタック内に留まり、A50はヘリックスから飛び出して結晶格子内の対称メイトFab分子と相互作用します(補足図8)。 P4b ヘリックスには、中央の C・U 塩基対の両側に U・U 塩基対を持つ Py-Py 領域が含まれています。

塩基対ヘリックス（P1、P2、P3、およびP4）、ジヌクレオチドバルジ、Py-Py塩基対領域、およびループ（L2、Py、Py）に関する5'CL2aの結晶由来の二次構造（図2a）。 L3、およびL4）は、SHAPE反応性分析および硫酸ジメチル（DMS）、1-シクロヘキシル-3-（ 2-モルホリノエチル) カルボジイミド メト-p-トルエンスルホネート (CMCT) およびケトキサール (図 1b、詳細については補足図 9 を参照)39、42、45。 さらに、sD サブドメイン全体と sB ヘリックスの構造は、溶液 NMR アプローチによって以前に分離して決定されたものとほぼ同一です (補足図 9)37、38、40、43。これは、5'CL2a 結晶構造がその構造を表していることを示唆しています。溶液形態。

a CVB3 5'CL2a コンストラクトの結晶由来の二次構造。 点線は、L3 ループ A40 と P4 ヘリックス Py-Py 領域間の三次相互作用を示します。 b sA サブドメインと sB サブドメイン間の三次相互作用。 c sC サブドメイン内のトリヌクレオチド ループの構造。 d CVB3 5'CL2a (赤色のトリループと紫色のステム) およびアグロバクテリウム tRNALeu (黄色) の結晶構造からの 5'-ccAUUgg-3' と 5'-ccUCUgg-3' ステムループ (RMSD = 0.44 Å) の重ね合わせ、PDB コード: 5AH5)60。 明確にするために、ループヌクレオチドのみを詳細に示しています。 e sDサブドメインP4ヘリックス内のジヌクレオチドバルジの構造。 (b) と (e) の黒い破線と赤い球は、それぞれ水素結合距離内のヘテロ原子と水分子を反映しています。 灰色のメッシュは 2|Fo | を表します。 -|FC | 等高線レベル 1σ、彫刻半径 1.8 Å での電子密度マップ。

5'CL2a の結晶構造では、最初の 10 ヌクレオチド (G1 ～ G10、5' 末端) が最後の 10 ヌクレオチド (C81 ～ C90、3' 末端) と標準的なワトソン クリック塩基対を形成し、P1 を構成します。ヘリックス、sA サブドメイン全体を表します (図 2a、b)。 P1-P2接合部内では、G10とC11の間で急激な曲がりが発生し、P2ヘリックス全体が曲がり、P1ヘリックスとほぼ平行に配置されます（図2a、b）。 次に、P2ヘリックスはループL2（Fab BL3-6の結合部位）によってキャップされ、完全なsBサブドメイン構造を形成します（図2a、b）。 WT 5'CLでは、L2ループはPCBPの結合部位を構成する8ヌクレオチドのCリッチモチーフを形成すると予想されます（補足図2）。 BL3-6結合モチーフの閉じているG20-C26塩基対を除くと、P2ヘリックスは9つのワトソンクリック塩基対で構成され、典型的なA型ヘリックスを形成しています（図2b）。これは以前の構造と一致しています。 RVB14 sB サブドメイン 41 の生化学的プローブおよび NMR モデルは、この sB ヘリックス構造がエンテロウイルス間でよく保存されていることを示しています。 さらに、直接および水を介した水素結合相互作用を介して、P1ヘリックスとP2ヘリックスの主鎖間の三次接触が観察され、sAとsBの全体的な並置が安定化しました（図2b）。 具体的には、G83 2'-OH は C29 骨格のリン酸酸素と直接水素結合を形成します。 それにもかかわらず、RVB1441のsBサブドメインのNMR構造に基づいて以前に提案されたように、主溝の拡大を含む、典型的なA型ヘリックスからのP2ヘリックスの顕著な逸脱は観察されませんでした。 CVB3 と RVB14 sB ヘリックスの主溝幅の違いは、これらの RNA 構造決定に使用される方法論の違いを反映している可能性がありますが 58、CVB3 と RVB14 sB ヘリックスの構造の違いは、塩基対の数が異なるためである可能性があります。 sBヘリックスを構成する4方向接合部に隣接します（補足図10）。 CBV3 sB サブドメインの 9 塩基対 sB ヘリックスは、RVB14 の 7 塩基対 sB ヘリックスによって形成される半分をわずかに超えるヘリックス ターンと比較して、ほぼ完全なヘリックス ターンを形成します。 さらに、CVB3 sBのすべての標準塩基対と比較して、RVB14 sBヘリックスには非標準G・Uペアが含まれています（補足図10）。

ヌクレオチドG36-C39およびG43-C46を含む4つの標準的なワトソンクリック塩基対は、P3ヘリックスを形成します（図2a）。 P2-P3接合部内では、P3ヘリックスのG36-C46がP2ヘリックスのG34-C11上に同軸に積み重ねられ、ほぼ連続したA型ヘリックスを形成します（図1c、2a）。 5'-AUU-3' 配列を持つトリヌクレオチド ループ L3 は P3 ヘリックスを閉じており、これは以前の生化学的プローブおよび SHAPE の結果と一致しています 39、42、45。 ループ内（図2c）では、C39とU41の間のヘリックスの急激な回転により、ヌクレオチドA40がヘリックス軸から十分に突き出ており、P4ヘリックスとの三次相互作用が可能になります。 C2'-エンドシングリコシド構造を持つヌクレオチド U41 は、ループを閉じる C39-G43 塩基対上に積み重なり、修飾が受けにくくなります。 U41とG43の間の2番目の急激な回転により、ヌクレオチドU42がらせん軸から外され、結晶格子内の対称性のあるFabと結晶接触する可能性があります。 それにもかかわらず、高い B 因子を持つ U42 核酸塩基で観察される電子密度の低さは、その非常に動的な性質を示唆しています。 このトリループで観察されたこれらの構造的特徴は、このトリループの U41 および U42 核酸塩基がそれぞれ中程度および強力に CMCT による修飾の影響を受けやすいという以前の生化学的精査結果と一致します 39,45。 さらに、RNA 構造ではトリループはテトラループよりも一般的ではありませんが、RNA CoSSMos データベース 59 を使用して以前に報告された RNA 構造でこのトリループ モチーフを検索したところ、トリループ内の正確な 5'-AUU-3' 配列はヒットしませんでした。 しかし、この5'-ccAUUgg-3'トリループの構造は、アグロバクテリウムtRNALeuの結晶構造で以前に観察された5'-ccUCUgg-3'トリループ（図2d、RMSD = 0.44Å）と重ね合わせることができました（PDBコード：5AH5） )60、これらのトリループが RNA モチーフの異なるクラスを表すことを示唆しています。

C46およびG47ヌクレオチドは、P3-P4接合部内で急激に曲がり、P4ヘリックス全体を曲げます。これにより、P4ヘリックスがP3ヘリックスとほぼ平行に配置され、P1ヘリックスとの同軸スタッキングが可能になります（図1c、2a）。 接合部の隣では、G47 および C48 がそれぞれ C80 および G79 と塩基対を形成し、P4a ヘリックスを形成します。 U49とA50による非対称ジヌクレオチドラッパは、P4aをP4bヘリックスから分離し、ここでU49はヘリックススタック内に残り、U49・G51-C78塩基三重形成に関与します（図2a、e）。 G51 と C78 はワトソン クリック塩基対を形成しますが、U49 と G51 はワトソン クリックおよびフーグスティーンの水素結合を介して相互作用します。 さらに、U49 O4 は C78 アミノ基と水素結合を形成します。 ヌクレオチドA50はヘリックスから飛び出し、結晶格子内の対称相手のFab分子と相互作用します。これはおそらく結晶化に重要です（補足図8）。 また、A50 の 2'OH は、その N3 と G51 O4' の水素結合距離内にあります。 バルジ ヌクレオチドの高度な保存と一致して、これらの構造的特徴は sD ヘリックスの安定性に不可欠であると思われます。 結晶構造は、結晶接触によって安定化された反転した A50 を備えたバルジのサンプル構造を表している可能性がありますが、バルジ内の強力な水素結合ネットワークが、このバルジの動的構成ではなく安定した構成をサポートしています。 また、49 番目のヌクレオチドは、エンテロウイルスの 5'CL 間で A50 に比べて保存度が低く、反転した A50 が 5'CL 結合タンパク質との相互作用に重要である可能性があることを示しています。 この膨らみは、おそらく、sD サブドメインのらせん軸を乱すことなく、sC ループとの三次相互作用のために Py-Py 領域の正しい位置を維持するのに役立ちます。 バルジに続いて、ヌクレオチド C52 ～ A61 は、高度に保存された Py-Py 塩基対を含む、U68 ～ G77 とワトソンクリック塩基対を形成します。 Py-Py領域では、ヌクレオチドU55、C56、およびU57が非標準的なワトソン-クリック水素結合を介してU74、U73、およびU72と塩基対を形成します（図3a）。 興味深いことに、Py-Py二重らせんは、その領域に隣接する二重らせん（リン酸からリン酸の直径 = 18.6 ± 0.6 Å、図3b）と比較してわずかに狭い（リン酸からリン酸の直径 = 16.8 ± 0.3 Å、図3b）。これは、CVB3 および RVB14 sD36、37、38、40、43 の NMR モデルにおける以前の観察と一致しています。 しかし、これらの異常な連続した Py-Py 塩基対 (U55・U74、C56・U73、および U57・U72) は、標準的な A 型ヘリックスから P4 内に重大な変形を引き起こしたり、ヘリックス末端の相対位置を変化させたりすることはありませんでした (参照)詳細については補足図 11)。 最後に、明確なテトラループ構造をとっている（図1c、2a）、塩基対を閉じるぐらつきU62・G67を有するループL4がP4ヘリックスを覆います。

a CVB3 5'CL2a の P4 ヘリックス内の Py-Py 塩基対の結晶構造。 b P4 ヘリックスを横切る塩基対間のリン酸塩間の距離。 c CVB3 5'CL2a サブドメイン sD 結晶構造 (シアン) と、以前に報告された CVB3 5'CL の sD サブドメインの NMR 構造 (青) およびエンテロウイルス コンセンサス配列 (マゼンタ) との重ね合わせ。 d (c) で説明した 3 つの構造の Py-Py 領域のみの重ね合わせ。 e P4 螺旋内の主溝の幅。 黒い破線は、らせんを横切る Pi と Pi+6 の間の距離を示しています。 f 結晶化 5'CL2a コンストラクトで観察される GNRA 型テトラループ構造。 g CVB3 5'CL38 の単離された sD サブドメインの以前の NMR 構造で観察された UNCG 型テトラループ。 黒い破線 (a)、(b)、および (e) は、水素結合距離内のヘテロ原子を表します。 (c) と (d) の灰色のメッシュは 2|Fo | を表します。 - |FC | 等高線レベル 1σ、彫刻半径 1.8 Å での電子密度マップ。

観察されたsDサブドメインの構造的特徴を以前に報告されたNMRモデルと比較するために、sDサブドメインの結晶構造を、CVB3およびエンテロウイルスコンセンサス配列のsDの以前のNMRモデル（最低エネルギー構造）と重ね合わせました（図3c、RMSD = 1.947）。それぞれ、Å、および 3.461 Å）37、38。 バルジ構造とループ L4 構造にはいくつかの違いが観察されましたが、Py-Py ヘリックスの構造は非常に類似していました（図 3d、RMSDs = 0.430 Å、および 1.266 Å）。 興味深いことに、我々の結晶構造とは対照的に、コンセンサス sD 構造は、裏返された U49 と螺旋状に積み重ねられた A50 を示しました。 この構成により、結晶構造で観察されるU49・G51-C78の代わりにベーストリプルA50・C48-G77を含む、C48、U49、A50およびG77が関与するH結合ネットワークの形成が可能になります（補足図12）。 この観察と一致して、無細胞系を使用した以前の研究では、(-)-鎖合成には単一ヌクレオチドのバルジで十分であることが示されています 14,20。 NMR モデルは分離された sD サブドメインに対して導出されたため、それぞれの配置が存在する可能性があります。あるいは、CVB3 5'CL2a の全体的な 4 方向接合フォールドが結晶構造で観察されるバルジ配置に有利である可能性があります。 CVB3 sD NMR モデルにはバルジ後の配列のみが含まれていたため、この比較ではこのモデルを除外しました。 次に、P4 ヘリックス内の主溝の幅を測定しました（図 3e）。 P4 ヘリックスを横切る Pi (G47 から始まる) と Pi+6 の間の測定された平均距離は 11.5 ± 2.9 Å であり、これは他の多くの RNA 結晶構造で観察される主な溝幅 (11.1 ± 2.2 Å) と一致しています 58。 我々の結晶構造におけるサブドメイン B の P2 ヘリックスの主溝幅の測定値も P4 ヘリックスの主溝幅 (11.6 ± 1.4 Å) と類似しており、P2 ヘリックスと P4 ヘリックスの両方が主溝幅に大きな偏差を示さないことを示唆しています。これは、sD ヘリックスと sB ヘリックスの両方が対応するタンパク質結合のための相互作用部位を提供するために幅広の主溝を有する NMR モデルに基づく以前の主張と矛盾します。 以前の NMR ベースの構造の平均主溝幅は 15.7 ± 4.7 Å58 であり、おそらく sB および sD ヘリックスで示唆された主溝幅の拡大が NMR モデリングに関連するいくつかの曖昧さによるものであることを反映しています。

これまでの生化学および NMR 研究では、sD ループがウイルスの 3Cpro 結合に必要かつ十分であることが示されています 14、20、36、37、38。 CVB3 3Cpro はテトラループを持つ他のエンテロウイルスの sD サブドメインと無差別に結合しますが、トリループを持つ RVB14 sD とは結合しないため 20、これらの研究は、3Cpro が定義された配列ではなく sD ループ内の全体的な構造特徴を認識することも示唆しました 20,37,38。 しかし、これらの以前の研究では、高度に保存された G66 変異が 3Cpro 結合に与える影響については検討されていませんでした。 解像度 1.9 Å で解析された CVB3 5'CL2a 構造には、G66C 変異が含まれています。 野生型 sD ループを含む構築物は結晶を生成しましたが、回折した分解能はわずか約 8 Å であり、この変異が堅牢な結晶化に必要であることが示唆されました。 さらに興味深いことに、この単一の変異は、sD テトラループの全体的な立体構造にとって重要であるようです。 私たちの結晶構造のsDサブドメイン内のL4ループ、5 '-auCACCgu-3 'はGNRA（N = 任意のヌクレオチド; R = AまたはG）タイプのテトラループフォールドを採用していますが（図3f）、CVB3を用いた以前のNMR研究sDサブドメインとエンテロウイルスコンセンサスは、WT sDループ、5'-auCACGgu-3'がUNCG（N = 任意のヌクレオチド）タイプのテトラループフォールドを採用していることを示しました（図3g）36、37。 これは、sD ループ配列、特にループ内の 4 番目のヌクレオチドも、sD ループの特定のテトラループ立体構造を維持するのに重要であることを意味し、これはエンテロウイルス 5'CL における G66 の高度な保存と一致します。 したがって、ＲＶＢ１４ ｓＤトリループの４番目のヌクレオチドとしてＧを挿入してテトラループを形成すると、ＣＶＢ３ ３Ｃｐｒｏへの結合がＣＶＢ３ ５'ＣＬ２０と同様のレベルに回復することが示された。

3Cpro と 5'CL の結合の構造的基礎を理解し、結晶構造の機能的関連性を検証するために、我々は組換え CVB3 3Cpro と我々の RNA 結晶化構築物との結合をテストしました。 以前の研究 61 に基づいて、我々は 3Cpro の触媒システイン (C147) をアラニンに変異させ、その潜在的なプロテアーゼ活性を回避しました。 ITC アッセイでは、CVB3 3Cpro が同様の親和性 (それぞれ見かけの Kd = 1.40 ± 0.14 μM および 1.30 ± 0.09 μM) で WT および 5'CL2 構築物に結合することが示され、sB ループへの Fab 結合配列の移植がほとんど影響を及ぼさないことが示唆されました。 sDループとの3Cpro結合について（図4a、b、詳細については補足図13を参照）。 sD ループが Fab 結合ペンタループで置換された 5' CL4 コンストラクトは、はるかに弱い親和性 (5' CL2 の 1.40 ± 0.14 μM と比較して、見かけの Kd = 9.4 ± 3.0 μM) を示し、3Cpro が sD ループを特異的に認識することを示唆しています。 CVB3 5'CL内（図4b;補足図13の詳細を参照）。 注目すべきことに、5 'CL2 RNAと比較して、sDループ内にG66C変異を含む5'CL2a結晶化コンストラクトは、3Cproとの結合がはるかに弱いことを示しました（見かけのKd = 17.0±8.0μM、図4b;補足図13を参照）詳細については）、3Cpro タンパク質認識における G66 の重要な役割を示唆しています。 ただし、UNCG 型の G66 と GNRA 型テトラループの C66 の相対的な位置は類似しており (補足図 4)、テトラループ立体構造が配列特異的な相互作用を超えて 3Cpro 結合において重要な役割を果たしていることを示しています。 総合すると、これらの分析は、3Cpro が sD ループ内の UNCG 型テトラループを認識し、この構造に変化を引き起こすあらゆる突然変異が 3Cpro とエンテロウイルス 5'CL の結合を無効にすることを裏付けています。

WT 5'CLの代表的なITCプロファイル。 熱は、熱量測定セル内の RNA 溶液 (約 10 μM) に 2 μl の CVB3 3C (約 400 μM) を連続的に注入すると放出されます。 b、c 3Cとさまざまな結晶化RNA構築物との結合に関するITCデータからの結合曲線（詳細については補足図13、14、および15を参照）。 d CVB3 5'CL2aの構造。sCとsDサブドメイン間の三次相互作用、特にsDサブドメイン内のP4ヘリックスのPy-Py領域へのsCループA40のドッキングを示す。 e Py-Py領域内のA40とC56・U73塩基対の間のAマイナータイプの三次相互作用の詳細。 f sC ループと Py-Py ヘリックスの間の A マイナー相互作用の破壊を示す A40U 変異モデル。 g 親5'CL2構築物のA40U変異体と3Cの結合に関するITCデータからの結合曲線。 (d)、(e)、および (f) の黒い破線は、水素結合距離内のヘテロ原子を表します。 d と e の灰色のメッシュは 2|Fo | を表します。 - |FC | 等高線レベル 1σ、彫刻半径 1.8 Å での電子密度マップ。

sD ループ変異体は 3Cpro に対する親和性の低下を示しましたが、これらの変異体の観察可能な親和性は、3Cpro と 5'CL のさらなる接触を示唆しています。 この仮説を検証するために、ジヌクレオチド バルジと Py-Py 変異体を使用して 3Cpro 結合研究を実行しました。 相補的ヌクレオチド（5'CL-sD-NB、補足図14）を追加することによるジヌクレオチドバルジの除去は、3Cproと比較して〜7倍低い親和性（見かけのKd = 10.1±2μM、図4c）を示しました。 WT 5'CL (見かけの Kd = 1.4 ± 0.14 μM、補足図 14)、バルジ ヌクレオチドと 3Cpro の直接接触を示します。 ただし、Py-Py領域が標準塩基対で置き換えられたコンストラクト（5'CL-sD-CN、補足図14）は、WT 5と同様の親和性（見かけのKd = 3.4±0.7μM、図4c）を示します。 'CLは、Py-Py領域が3Cpro結合に直接関与する可能性が低いことを裏付けています。 さらに、以前の報告20と一致して、単離されたsDサブドメイン（sDi、補足図15）は、無傷のWT 5'CLと同様の親和性（見かけのKd = 2.1±0.12μM、図4c）で3Cproに結合します。 sD サブドメインは、sD ループと sD バルジの特異的相互作用を介した 3Cpro 結合に十分です。 さらに、U49A50 (sDi-NB、見かけの Kd = 5 ± 0.1 μM)、U49 のみ (sDi-U49P、見かけの Kd = 4.9 ± 0.87 μM)、または A50 のみの両方の標準塩基対を持つ単離 sD コンストラクトを使用した 3Cpro 結合研究（sDi-A50P、見かけのKd = 3.5±0.6μM）は、バルジヌクレオチドのアイデンティティではなく、バルジの全体構造が3Cpro結合にとって重要であることを示しています（コンストラクトとITCデータについては補足図15を参照）。 これらの結果は、以前の NMR37 および我々の結晶構造で観察されたバルジの 2 つの異なる立体構造と一致しており、in vitro 複製研究では、U49 または A50 のいずれかではなく U49A50 の両方の欠失、またはそれらの位置の交換が (-)-鎖合成を無効にすることを示しています 14 、20。

我々の全長CVB3 5'CLの結晶構造により、L3ループとP4ヘリックスのPy-Pyベースのペア領域間の前例のない相互作用を含む、sCとsDサブドメイン間の広範な三次相互作用が明らかになった。 まず、P3およびP4ヘリックス骨格は、直接および水を介した水素結合のネットワークを通じて相互作用します（図4d）。 G75 および U74 のリン酸酸素は、それぞれ G44 および C38 の 2'OH 基と直接水素結合を形成します。 G75 リン酸酸素は、G44 の N3、2'OH、およびアミノ基との水媒介水素結合にも関与しています。 sCとsDサブドメイン間のこれらの接触に加えて、興味深いことに、私たちの結晶構造は、L3ループA40がAマイナータイプの相互作用を通じてPy-Pyヘリックスのマイナー溝にドッキングしていることを明らかにしました（図4e）。 A40 は、ワトソン-クリック-シュガーエッジおよびフーグスティーン-シュガーエッジの水素結合相互作用を通じて C56 および U73 と接触し、A40・C56・U73 ベーストリプルを形成します。 具体的には、C56およびU73 2'OH基はそれぞれA40 N1およびN7と相互作用し、それらのO2は直接水素結合を通じてA40アミノ基と相互作用します（図4e）。 溶液中での A40 のドッキングを検証するために、我々は 5'CL2 構築物の NMR 研究を実施しました。 A2RU6R標識スキームのさまざまなバリエーションを適用することにより（「方法」を参照）、2つのウラシルのA40 H2とH1の間のNOE（核オーバーハウザー効果）シグナルが観察されました（補足図16）。これは、A40とPy-Py相互作用と一致しています。私たちの結晶構造では、U57とU74のH1'がA40のH2に近い（<4Å、補足図16）。

Mg2+ などの二価カチオンは、RNA の三次構造を安定化させることが知られています。 それにもかかわらず、溶液中の Mg2+ の有無は 3Cpro と 5'CL 構築物の結合親和性を有意に変化させませんでした (5'CL2 については、10 mM Mg2+ での見かけの Kd = 1.30 ± 0.09 μM と比較して 1.4 ± 0.2 μM)これは、二次構造的特徴と比較して、5'CL 内の長距離三次構造が 3Cpro 結合に大きな影響を及ぼさない可能性があることを裏付けています。 特に、5 mM Mg2+を含む溶液およびMg2+透析溶液中のCVB3 5'CL2a構築物の1Dおよび2D NMRスペクトルは、ほぼ重ね合わせることができます（補足図17）。 小さな塩依存性の化学シフトのみが観察されますが、より大きな構造変化によるピークの強度の大きなシフトや変化は観察されず、RVB14 5'CL20とは異なり、CVB3 5'CLがコンパクトなH型に折りたたまれていることが示唆されます。溶液中の Mg2+ に依存しない 4 方向ジャンクション。 NMR の結果と一致して、結晶化条件には少なくとも 10 mM Mg2+ が含まれていたにもかかわらず、1.9 Å 分解能でも結晶構造内に目立った Mg2+ 結合部位は観察されませんでした。

エンテロウイルスの5'CLの中で高度に保存されたA40ヌクレオチドとPy-Pyヌクレオチド間の長距離相互作用は、これらのヌクレオチドが3Cproと5'CL構造との結合に重要な役割を担っている可能性を示唆している。 予想通り、A40またはPy-Py変異は5'CL三次構造を不安定化し(図4fを参照)、3Cproの結合親和性を低下させるであろう。 しかし、CVB3 5'CL2のsCトリループ内のA40U変異は、3Cproと5'CLの結合にはほとんど影響を与えませんでした（5'CL2のKd = 1.40±0.14μMと比較して、見かけのKd = 3.10±0.22μMでした（図1）。ただし、A40U 変異体に対する親和性のこのわずかな減少は、この A40U 変異によって誘発された 5'CL 構造内の小さな立体構造変化によるものである可能性があります (図 4f を参照)。無傷の野生型5'CLと3Cpro結合の分離されたsDサブドメインのITC測定（それぞれ見かけのKd = 1.4±0.14μMおよび2.10±0.12μM;図4b、c、補足図13および15）。フィルター結合アッセイに基づくこれらの RNA 構築物の 3Cpro に対する親和性 (それぞれ、見かけの Kd = 2.7 および 4.6 μM)20 も以前に報告されており、A40 相互作用が 3Cpro への結合に直接的な役割を持たないことが裏付けられています。野生型 5'CL、および 5'CL-sD-CN（標準ペアで置き換えられた Py-Py）も同様に構築されます（図 4c; 補足図。 14および15)、これは、Py-Pyヘリックスを標準塩基対で置換しても(-)-鎖合成が破壊されなかったという以前の観察と一致している14。 しかし、酵母スリーハイブリッドアッセイで示されるように、U74 の欠失は無効になりましたが、代償的な C56U 変異により 5' CL20 との 3Cpro 結合は依然として維持されました。 構造結果と 3Cpro 結合の結果を総合すると、効果的な 3Cpro 結合には sD サブドメインの全体構造を保存するジヌクレオチド バルジとループの完全性が必要であり、A40U-Py-Py の三次相互作用がそれ以上の影響を与えることが明らかです。 3Cproバインディング。

我々は、これらの相互作用のより顕著な構造的役割は、潜在的な立体衝突を避けるために、3Cpro結合部位（sDループ）を宿主PCBP結合部位（sBループ）から離して配置する5'CLの4方向結合を安定化させることであると仮説を立てた。複製機械の組み立て中に 3Cpro と PCBP の間で行われます。 この仮説を検証するために、全長ヒトPCBP2タンパク質を組換えにより発現および精製し、ゲル電気泳動を使用して結合アッセイを実行しました（補足図18）。 PCBP2 は sB ループと 5'CL と IRES の間の C-rich スペーサー領域の両方に結合することが示されているため、5'CL とスペーサー領域の両方を含むより長い RNA 構築物を使用した結合テストも実行しました。 PCBP2がsBループを認識するという以前の研究と一致して、本発明者らは、sBループ変異体5'CL2ではなくWT 5'CLがPCBP2に結合することを観察した。 興味深いことに、3Cpro 結合に影響を及ぼさなかった A40U 変異体は、WT 5'CL と比較してはるかに低い親和性で PCBP2 と相互作用します。これは、A40-Py-Py 相互作用が PCBP2 の 5'CL への結合に何らかの役割を担っていることを示唆しています。構造。 驚くべきことに、sB ループとスペーサー配列を備えたより長い RNA 構築物 5'CLWTSP は、スペーサーのない 5'CL と比較して PCBP2 にしっかりと結合します。これは、sB ループとスペーサー配列が互いに近くに存在することを示しており、これは結晶構造においてsAサブドメインとsBサブドメインの並置が観察されました。 PCBP2結合および5'CL機能に対するA40-Py-Py相互作用の影響はまだ十分に研究されていないが、我々の予備的結果は、H型5'CL構造がこのA40-Py-Py長距離接触並置を安定化していることを示唆しているPCBP2結合部位、sBループ、および3Cpro結合部位、sDサブドメインから十分に分離されたスペーサー。

エンテロウイルスの 5'CL 内のヌクレオチドの構造的関連性を研究するために、バイオインフォマティクス ツールを使用して系統解析を実行しました。 5000を超えるエンテロウイルスゲノム配列のアラインメントは、5'CLs領域内の高度な配列保存を示しています（補足図19）。 R-Scape62を使用した7つのエンテロウイルス遺伝子型のこれらの配列アラインメントから計算されたコンセンサス二次構造（図5a;補足図20）は、各サブドメインsA、sB、sC、およびsD内の構造的特徴が高度に保存されていることを示しており、以前に提案された、Rfam データベース 63 のエンテロウイルス 5'CL のコンセンサス二次構造は、87 エンテロウイルス種のみからの 162 配列をアラインメントすることによって得られました。 注目すべきことに、A40、Py-Py、およびsDバルジを含むCVB3 5'CL結晶構造で観察される重要なヌクレオチドは完全に保存されており、これらのヌクレオチドを強い選択圧に対して維持するためのウイルスの要件が示唆されています。 興味深いことに、R-scape62 の最適化されたコンセンサス二次構造は、sC サブドメインがトリループ内の 3 番目のヌクレオチドとして完全に保存された A40 を持つトリループで閉じられた 4 塩基対のヘリックスであると予測します。 同様に、sD サブドメインには、四方向接合部と Py-Py 塩基対領域の間に高度に保存された 6 塩基対のヘリックスが含まれています。 このヘリックスは、四方向接合部に続く第 2 塩基対と第 3 塩基対の間の 2 塩基のバルジによっても中断されています。 この特定の配置によるsCおよびsDサブドメイン内の長さと二次構造の保存（補足図21）は、観察された三次相互作用と一致して、L3ループとPy-Pyベースのペア領域間の特異的な相互作用を維持するためにおそらく必要です。私たちの結晶構造では。

a コンセンサスエンテロウイルス 5'CL の提案された二次構造モデル (詳細については補足図 20 も参照)。 5'CLはエンテロウイルス間で最も保存されたRNAエレメントの1つです（b）ウイルス3CDと宿主PCBPの結合モードを示すCVB3 5'CLの結晶構造に基づくエンテロウイルスゲノムにおける5'CLの三次元コンセンサスフォールドタンパク質。 赤い破線は三次相互作用を表し、対応するサブドメインの同軸積層を示します。

エンテロウイルスのゲノム複製には 2 つの異なるステップがあります。 1つ目はゲノムRNAを鋳型とした(-)鎖RNAの合成、2つ目は新たに作製した(-)鎖RNAを鋳型とした(+)鎖ゲノムRNAの逆合成である。 5'CLは、ウイルスおよび細胞タンパク質因子に直接結合して複製能力のあるRNP複合体を形成するエンテロウイルスゲノム複製機構の主要構成要素の1つです。 5'CLのsDサブドメインは、ウイルスポリメラーゼDpolを複製開始部位に導く3Cproを介してウイルス3CD融合タンパク質と相互作用する。 sB サブドメインは PCBP2 に結合し、PCBP2 は 3' 末端で PABP-ポリ (A) テール複合体と相互作用してウイルスゲノムを環状化します。 3CD はまた、2C コード領域内に位置するステムループ RNA ドメインである cre と相互作用して、ウイルス VPg タンパク質のウリジル化を促進します。 得られた VPg-pUpU は、3CD 前駆体の自己切断産物である活性 Dpol ポリメラーゼによる (-) 鎖 RNA 合成のプライマーとして機能します。 さらに、5'CL の保存された RNA 配列と構造的特徴は、VPg ウリジル化とウイルスゲノムの安定性に影響を及ぼし、無数の細胞 RNA 環境において複製機構がエンテロウイルス ゲノムを認識するのを促進する可能性があります 64。 したがって、5’CLの高分解能構造と、3Cまたは3CDおよびPCPBとの対応するRNP複合体は、ウイルス学的プロセスのほとんどが理解されていないエンテロウイルスゲノム複製のメカニズムを詳細に理解するだけでなく、医薬品の開発にも重要な情報を提供します。このプラットフォームをターゲットとするもの。 これまでのウイルス学、分子生物学、生化学、生物物理学的なアプローチにより、エンテロウイルスゲノム複製を開始するための 5'CL の構造的および機能的理解、およびそのサブドメインが分子レベルで 3C または 3CD および PCPB タンパク質とどのように相互作用するかについてはある程度の理解が促進されました 36,37,38。 39,40,41,42,43,44、我々の CVB3 5'CL 結晶構造は、エンテロウイルス由来の無傷の 5'CL の最初の高分解能構造を表しており、5'CL を介したウイルスのさらなる研究のための基礎を確立しています。エンテロウイルスの複製メカニズム。

単離された sC および sD サブドメインの NMR 由来モデルを含む、CVB3 および RVB14 5'CL の全体的な二次構造は、ほぼ同一です。 ただし、CVB3 5'CL 結晶構造の 3 次元構造は、RVB14 5'CL モデルと大きく異なります。 RVB14 5'CL モデル 43 とは異なり、本発明の結晶構造は、同軸に積み重ねられた sA-sD および sB-sD サブドメインを備えた H 型 4 方向接合を採用しており、sA と sB、および sC と sD が並置されています。 これらの不一致は、おそらく、SAXS 技術の解像度の低さと、sA および sC サブドメインの構造を考慮せずに、単離された sB および sD サブドメインの NMR 構造のみに基づいた無傷の 5'CL 構造の計算モデリングに関連していると考えられます。 さらに、NMR および SAXS アプローチを使用して、Warden et al. 43 は以前に、全長 RVB14 5'CL の Mg2+ 依存構造モデルを提案しました。 Mg2+ がないと、RVB14 5'CL は、sB サブドメインと sD サブドメインが互いにほぼ垂直に存在する cK 型 4 方向結合に似た拡張した立体構造をとりましたが、Mg2+ があると、同じ RNA がよりコンパクトな立体構造に折りたたまれます。 sB サブドメインと sD サブドメインを並べたものです。 さらに、RVB14 5'CL は、Mg2+43 の添加により、Py-Py ヘリックスに関与するヌクレオチドの NMR 化学シフトに実質的な変化を示しましたが、これは、単離された同じ sD サブドメインで観察されたものとは一致しませんでした 40。 しかし、これらの観察は、我々の無傷のCVB3 5'CL結晶構造で観察されるような、ループL2との三次相互作用によるPy-Py領域の安定化と一致する。 RVB14 での以前の結果とは異なり、さまざまなエンテロウイルス 5'CL の Mg2+ 依存性立体構造はまだ詳細に研究されていませんが、我々の予備的な NMR 結果は、CVB3 5'CL が Mg2+ とは独立してコンパクトな H 型 4 方向接合構造に折りたたまれることを裏付けています。これは、異なるエンテロウイルス 5'CL の安定化における Mg2+ の異なる役割を示唆しています。

これまでの研究では、エンテロウイルスゲノム複製の有効性が、5'CL構造内のPCBPと3Cまたは3CDタンパク質の相互作用部位に依存することが示されている。 sD サブドメインは 3C バインディングに必要かつ十分です。 したがって、バルジ、Py-Py 領域、およびテトラループ構造は、(+) 鎖 RNA 合成と (-) 鎖 RNA 合成の両方に大きな影響を与える sD サブドメイン内で最も保存された領域です。 CVB3 の場合、ジヌクレオチド バルジ U49A50 の欠失は (-) 鎖合成を阻害しましたが、これらのヌクレオチド位置を交換する変異 A49U50 と U49 または A50 ヌクレオチドの欠失はほとんど影響を及ぼさず、単一ヌクレオチド バルジで十分であることを示唆しています ( -)-ストランド合成。 ただし、(+) 鎖の合成には、完全なジヌクレオチドのバルジが必要でした。 Py-Pyヘリックス内のU74の欠失により5'CLとの3C結合が消失したが、以前のNMRデータはタンパク質とPy-Py領域のヌクレオチドとの直接相互作用を裏付けなかった。 しかし、C56・U73をU56・U73ペアに置き換えると、5'CLとの3C結合が保存された。 PV および CVB3 の無細胞アッセイを使用したさらなる研究では、ワトソンクリック塩基対による Py-Py ミスマッチを完全に除去すると、(-) 鎖合成が増加する一方、(+) 鎖合成が減少することが示されました。 sD サブドメイン内の領域は、ウイルス感染中に (-) と (+) RNA 鎖の比率を維持するために不可欠です。 構造的に、Py-Py 領域は A 型ヘリシティを維持しており、A 型ヘリシティを変化させない変異は依然として sC ループと Py-Py 領域間の A マイナー タイプの相互作用を可能にしますが、同様のシナリオはよりまれです。おそらく (-) 鎖の 3' 末端に類似の構造があると考えられます。 おそらく、5'CL の Py-Py 領域の要件は、(-) 鎖 RNA テンプレートを使用した (+) 鎖合成でより顕著になります。 (-) 鎖 RNA の 3' 末端内に形成される類似の RNA 構造の構造を研究することはこの研究の範囲を超えていますが、我々の結晶構造は、Py-Py 領域が全体の 5'CL 構造を安定化していることを裏付けています。 sCループとの三次相互作用を通じて。 また、単離された sD サブドメインは、無傷の CVB3 5'CL と同様の結合親和性を示し、エンテロウイルス間で sD サブドメインの完全に保存された構造的特徴が 3C タンパク質の結合を超えて重要であることが示唆されます。 さらに、(-) 鎖および (+) 鎖合成における A40 を含む sC ループ変異の影響はまだ調査されていませんが、強い選択圧に対する A40 の絶対的な保存は、これらの完全性を維持する必要性を強調しています。ウイルスゲノム複製のための三次相互作用。

我々の CVB3 5'CL 構造を他のエンテロウイルスやライノウイルスと比較すると、P3 ヘリックス (4 塩基対) と Py-Py 領域に先行する P4 ヘリックス (ジヌクレオチドのバルジによって中断された 6 塩基対) の長さが、最も保存された構造的特徴。 これらの特徴は、sC サブドメインと sD サブドメイン間の三次相互作用を促進するために A40 および Py-Py ペアを配置するための特定の要件を強調しています。 5'CL 内のこれらの三次相互作用は、PCBP 結合部位を考慮するとより顕著になります。 エンテロウイルスの 5'CL 内では、PCBP は sB ループおよび 5'CL 構造の末端にある C-rich スペーサー配列と相互作用し、後者の配列が結合相互作用により多く寄与します。 サブドメイン B およびスペーサー領域内の C リッチ配列への変異により PCBP 結合が消失し、(-) 鎖 RNA 合成が悪化することから、これらの領域における PCBP 結合がエンテロウイルスゲノムの効率的な複製に重要であることが裏付けられています 19,27,28。 sDおよびsBサブドメインが並置されたこれまでに提案されたRVB14 5'CLモデルとは異なり、CVB3 5'CLの結晶構造はsAおよびsBサブドメインが並置され、sBループとCリッチスペーサー配列が互いに接近していることを明らかにした。 (図5b)、これはヒトPCBP2との予備的な結合研究と一致しており、以前の生化学的観察を裏付けています。 したがって、sCループとPy-Py領域間の三次相互作用は、5'CL構造の安定化とsBおよびsDループの正確な位置決めにおいて重要な役割を果たし、複製コンポーネントが直接関与するのではなく結合するための既製のプラットフォームを提供しますこれらの部分構造と 5'CL タンパク質の相互作用。 しかし、対応するウイルスタンパク質 3C または 3CD および宿主タンパク質 PCPB2 と複合体を形成したエンテロウイルス 5'CL の高分解能構造を決定するさらなる研究は、エンテロウイルス複製の機構的理解と、このエンテロウイルス複製プラットフォームを標的とした潜在的な治療法の開発に向けた重要な一歩となるでしょう。 。

結晶化、タンパク質結合、および NMR 研究のための RNA 構築物は、in vitro 転写によって合成されました。 転写反応用の T7 プロモーター配列を含む DNA テンプレートは、Integrated DNA Technologies から購入した ssDNA の PCR 増幅によって生成されました。 リバースプライマーの最初の 2 ヌクレオチドは、転写産物の 3' 末端の不均一性を低減するために 2'-OMe 修飾されています 65。 RNA は、40 mM Tris-HCl、pH 8.0、2 mM スペルミジン、10 mM NaCl、25 mM MgCl2、1 mM DTT、40 U/ml RNase 阻害剤、5 U/ml を含むバッファー中で 37 °C で 3 時間転写されました。 TIPPase、5 mM の各 NTP、50 pmol/ml の DNA テンプレート、および 50 μg/ml の自家製 T7 RNA ポリメラーゼ 66。 転写反応は、10 U/ml DNase I (Promega) を添加し、37 °C で 1 時間インキュベートすることによってクエンチされました。 NMR サンプルを合成するために、Cambridge Isotope Laboratories から購入した標識 NTP を使用して RNA を転写しました。 RNAを8時間転写し、反応を500 mM 尿素および60 mM EDTAでクエンチし、続いて混合物を5分間煮沸した。 すべての RNA サンプルは、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (dPAGE) によって精製されました。 バンドを UV シャドウイングによって視覚化し、ゲルから切り出し、10 mM Tris、pH 8.0、2 mM EDTA、および 300 mM NaCl 中で 4 °C で一晩溶出しました。 10 kDa カットオフの Amicon カラム (Millipore Sigma) を使用して、溶出した RNA のバッファーを純水と 3 回交換しました。 RNAを収集し、300 μlの画分に等分し、さらに使用するまで-80 °Cで保存しました。 NMR サンプルの場合、RNA はエタノール沈殿によってさらに精製された後、凍結乾燥され、NMR 測定のためにバッファー交換されました。

Fab BL3-6 発現プラスミドは、シカゴ大学の Joseph Piccirilli からのご厚意により提供されました。 Fab は、公開されているプロトコル 52、67、68 に従って精製されました。 簡単に説明すると、プラスミドを55244個の大腸菌コンピテント細胞に形質転換し、100μg/mlのカルベニシリンを含むLB寒天プレートに画線塗布した。 いくつかのコロニーを選択して15 mlのスターター培養物に接種し、30℃で8時間増殖させました。 次に、スターター培養物を使用して 1 リットルの 2xYT 培地に接種し、細胞を 30 °C で 24 時間増殖させました。 Fab 過剰発現の場合、細胞を 22 °C、6000 × g で 10 分間遠心分離し、1 リットルのリン酸除去培地に再懸濁し、30 °C で 24 時間増殖させました。 細胞を 4 °C、6000 × g で 10 分間遠心分離して回収し、0.01 mg/ml ウシ膵臓 DNase I (Sigma-Aldrich) および 400 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド (PMSF) を含む PBS、pH 7.4 緩衝液に再懸濁しました。超音波処理 (Qsonica、Cole-Parmer) によって溶解します。 まず混合物を 40,000 × g で遠心分離し、透明なライセートを 0.45 ミクロンのフィルター (VWR) で濾過し、Bio-Rad NGC 高速タンパク質液体クロマトグラフィー (FPLC) システムを使用して Fab を精製しました。 まず、ライセートを Hi-trap プロテイン A カラム (Cytiva) に通し、捕捉された Fab を 0.1 M 酢酸で溶出しました。 画分を収集し、PBS、pH 7.4緩衝液を使用して10倍に希釈し、Hi-trapプロテインGカラム(Cytiva)にロードした。 ０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７中のプロテインＧカラムから溶出したＦａｂ画分を収集し、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５緩衝液で１０倍に希釈し、Ｈｉ－ｔｒａｐヘパリンカラム（Ｃｙｔｉｖａ）にロードした。 最後に、50 mM NaOAc、2 M NaCl、pH 5.5 緩衝液を使用した勾配溶出によってヘパリンカラムから溶出された Fab 画分を収集し、30 kDa カットオフの Amicon カラム (Millipore Sigma) を使用して緩衝液を 1x PBS pH 7.4 で 3 回交換しました。 。 濃縮された Fab を収集し、12% SDS-PAGE で分析し、RNaseAlert キット (Ambion、www.thermofisher.com) を使用して RNase 活性についてテストしました。 精製したFabのアリコート(約300μl)を-80℃で保存した。

水中の RNA (約 100 ng) を、10 mM Tris-HCl、pH 7.4、10 mM MgCl2、および 100 mM NaCl を含む緩衝液中でリフォールディングしました。 RNAを90℃で1分間加熱し、適切な量の10×リフォールディングバッファーを添加し、続いて50℃で10分間インキュベートし、その後氷中で5分間インキュベートした。 次いで、再折り畳みされたＲＮＡを、異なる等量のＦａｂまたは ３ Ｃタンパク質とともに室温で３０分間インキュベートした。 タンパク質-RNA複合体サンプルを、グリセロール30%、ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノールをそれぞれ0.1%含む適切な量の6xネイティブアガロースゲルローディング溶液と混合しました。 これらのサンプルを 10% 天然ポリアクリルアミドゲルにロードし、4 °C で予冷した 0.5x TBE 緩衝液 (50 mM トリス塩基、50 mM ホウ酸、および 1 mM EDTA、pH 7.5) 中で 115 V で実行しました。 ゲルを臭化エチジウムで染色し、Azure 200 ゲル ドキュメンテーション システム (Azure Biosystems) を使用して画像化しました。

RNA サンプルを、10 mM Tris-HCl、pH 7.4、10 mM MgCl2、および 100 mM NaCl を含むフォールディングバッファー中でリフォールディングしました。 まず、水中の RNA を 90 °C で 1 分間加熱し、適切な量の 10x リフォールディング バッファーを添加し、続いて 50 °C で 10 分間、氷中で 5 分間インキュベートしました。 次いで、再折り畳みされたＲＮＡを１．１当量のＦａｂとともに室温で３０分間インキュベートし、１０ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を使用して６ｍｇ ｍＬ−１に濃縮した。 次に、Fab-RNA 複合体を 0.2 μm カットオフの Millipore 遠心フィルターユニット (www.emdmillipore.com) に通しました。 Xtal3 Mosquito 液体ハンドリング ロボット (TTP Labtech、ttplabtech.com) を使用して、Hampton Research および Jena Bioscience から市販されているスクリーニング キットを使用して、室温でハンギング ドロップ蒸気拡散結晶化スクリーンをセットアップしました。 結晶はさまざまな条件で 1 週間以内に形成されました。 選択した条件は、ハンギング ドロップ蒸気拡散法を使用してより大きな結晶を成長させるために、pH、沈殿剤、および塩濃度に関してさらに最適化されました。 結晶は 1 週間かけてフルサイズに成長しました。 凍結保護のために、他の組成を変更せずに、適切な結晶を含む液滴を 30% グリセロールに加えました。 結晶は水滴から採取された後すぐに液体窒素中で急速冷凍され、X 線回折データを収集するためにアルゴンヌ国立研究所に運ばれました。

X 線回折データセットは、Advanced Photon Source NE-CAT セクションのビームライン 24-ID-C および 24-ID-E で収集されました。 次に、オンサイトの RAPD 自動プログラム (https://rapd.nec.aps.anl.gov/rapd/) を使用して、すべてのデータセットが統合され、スケーリングされました。 初期フェーズは、以前に報告された Fab BL3-6 の構造 (PDB: 6B14 を検索モデルとして、Phenix69 の Phaser を使用) と分子置換することによって得られました。反復モデルの構築と改良は、COOT70 および Phenix パッケージ 69 を使用して実行されました。RNA は、以下によって明確に構築されました。分子置換から得られた電子密度マップに個々のヌクレオチドをモデル化します。改良中、デフォルトの NCS オプションと Phenix で自動選択された TLS パラメーターが使用されました。ほとんどの水分子は、改良中に Phenix ソフトウェアによって自動的に決定されました。ただし、一部の水分子は、マップ内の正電子密度は、タンパク質または RNA 残基と水素結合を形成する可能性に基づいて手動で追加されました。溶媒アクセス可能な表面積と相互作用面積は、(http://www.ebi.ac.uk/) を使用して計算されました。 pdbe/pisa/)57. 構造関連の図は PyMOL (PyMOL Molecular Graphics System、バージョン 2.0 Schrödinger, LLC) で作成され、図のラベルは CorelDraw (Corel Corporation、http://www.corel.com) で編集されました。 。

組換え CVB3 3Cpro は、いくつかの変更を加えた前述のプロトコールを使用して発現および精製されました 20、38、61。 CVB3 3Cpro C147A 変異体をコードするコドン最適化 DNA 配列を、NdeI と XhoI 制限部位の間の pET-22b(+) ベクターにクローニングしました (GenScript、https://www.genscript.com)。 発現されたタンパク質には、MGPAFEFAVA MMKRNSSTVK TEYGEFTMLG IYDRWAVLPR HAKPGPTILM NDQEVGVLDA KELVDKDGTN LELTLLKLNR NEKFRDIRGF LAKEEVEVNE AVLAINTSKF PNMYIPVGQV TEYGFLNLGG TPTKRMLMYN FPTRAGQAGG VLMSTGKVLG IHVGGNGHQG FSAALLKHY の配列が含まれていました。 C 末端に 6x-His タグをコード化したベクターを持つ F NDEQ。 発現プラスミドを BL21 (DE3) E.coli に形質転換し、細胞を 100 μg/mL カルベニシリンを添加した 2xYT 培地で 37 ℃、220 rpm で振盪しながら OD が約 0.6 になるまで培養しました。 次に、IPTG (イソプロピルチオ-β-ガラクトシド) を最終濃度 0.5 mM で使用して細胞のタンパク質発現を誘導し、25 °C で 6 時間増殖させ、最後に 6000 x g での遠心分離によって回収しました。 タンパク質の精製は、Bio-Rad FPLC システムで実行されました。 細胞ペレットを、50 mM Tris HCl、pH 7.5、300 mM NaCl、および5 mM イミダゾールを含む溶解バッファーに再懸濁し、超音波処理を使用して溶解しました。 溶解物を 40,000 × g、4 °C で遠心分離し、上清を 0.45 ミクロンのフィルターに通しました。 次に、清澄化したライセートを HisTrap™ カラム (Cytiva) にアプライし、カラムを 5 で洗浄した後、緩衝液 (50 mM トリス HCl、300 mM NaCl、および 250 mM イミダゾール、pH 7.5) でカラムからタンパク質を溶出しました。溶解バッファーのカラム容量。 溶出画分を収集し、50 mM Tris HCl、100 mM KCl、1 mM EDTA、および5% グリセロールを含む緩衝液（pH 7.5）に対して透析し、サイズ排除クロマトグラフィー（HiLoad® 26/600 Superdex® 200 pg）によってさらに精製しました。コラム、Cytiva）。 単一ピークのタンパク質画分をプールし、Amicon 遠心分離フィルター (分子量カットオフ 10 kDa、Millipore Sigma) を使用して濃縮し、少量ずつ液体 N2 で瞬間冷凍し、-80 °C で保存しました。

C 末端 6x-His タグを持つ全長ヒト PCBP2 (残基 11 ～ 359) を、いくつかの変更を加えた前述のプロトコールを使用して発現および精製しました 28,71。 簡単に説明すると、ヒト PCBP2 タンパク質をコードするコドン最適化 DNA 配列を、NdeI と XhoI 制限部位の間の pET-22b(+) ベクターにクローニングしました (GenScript、https://www.genscript.com)。 発現および精製は、3Cpro について上で論じたのと同様の手順を使用して実行されました。 溶解バッファーには 50 mM Tris (pH 7.5)、300 mM NaCl、および 20 mM イミダゾールが含まれていましたが、HisTrap カラム溶出バッファーには 50 mM Tris (pH 7.5)、300 mM NaCl、および 250 mM イミダゾールが含まれていました。 溶出画分を収集し、50 mM Tris (pH 7.5)、100 mM KCl、1 mM EDTA、および 5% グリセロールを含む緩衝液に対して透析し、HiLoad® 26/600 Superdex® 75 pg を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製しました。カラム。 単一ピークのタンパク質画分をプールし、Amicon 遠心分離フィルター (分子量カットオフ 30 kDa) を使用して濃縮し、少量ずつ液体 N2 で瞬間冷凍し、さらに使用するまで -80 °C で保存しました。

等温滴定熱量測定 (ITC) 実験は、新たに調製した RNA およびタンパク質サンプルを使用して、MicroCal PEAQ-ITC Automated (Malvern Panalytical) 装置で実施しました。 RNAおよびタンパク質サンプルを、50 mM Tris HCl、pH 7.5、100 mM KCl、1 mM EDTA、および5% グリセロールを含む緩衝液中で一晩透析した。 注射器には 150 μl の約 400 μM 3Cpro タンパク質が含まれており、熱量測定セルには 500 μl の約 10 μM RNA がロードされました。 25 °C での熱平衡化と最初の 60 秒の遅延の後、200 nl を 1 回注入し、続いて 2 μl の 3Cpro タンパク質を 19 回連続注入して熱量測定セルに注入しました。 各 RNA 構築物について報告された Kd は、3 回の実験から得られた平均 ± 標準偏差を表します。

RNA サンプルは、5 ml チューブ内で、20 mM リン酸ナトリウム、pH 7.4、70 mM KCl、5 mM NaCl、および 5 mM MgCl2 (別段の記載がない限り) を含む 100% D2O (99.8%、Cambridge Isotope Laboratories) 中で測定されました。 0.7 ～ 1.2 mM の範囲で変化します。 データは、Bruker AVANCE 分光計 (600 MHz、1H) を使用し、加重サンプリング スキームを使用して 308 K で収集されました72。 交換不可能な 1H 割り当ては 2D NOESY データから得られました (NOE 混合時間 = 300 ミリ秒、緩和遅延 = 12.0 秒、T = 308 K)。 すべての NMR データは NMRFX73 で処理され、NMRViewJ74 で分析されました。 部分的な割り当ては、初期の研究で開拓された戦略 77 に従って、A2RUR、U6R、および A2R 標識 RNA サンプルに対する標準的な NOE ベースの逐次割り当て戦略 75,76 を使用して行われました。 割り当ては、NMRViewJ78、79、80 を使用して、BioMagResBank NMR リポジトリの化学シフト値と比較することによって検証されました。 さらに、以前の割り当ては、割り当ての一部を転送および相互検証するために使用されました 36,37。

他に指定しない限り、ネイティブ PAGE、SDS PAGE、および ITC に関連する実験は 3 回実行されました。 各反復では同様の結果が得られました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

報告された結晶構造の原子座標と構造因子は、アクセッション コード 8DP3 でタンパク質データ バンクに寄託されています。 著者らは、ご要望に応じて、生データ、追加情報、および Fab BL3-6 発現用のプラスミドを含む材料を提供します。 リクエストはDKに宛ててください。

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この研究は、メリーランド大学ボルチモア郡からのスタートアップ賞、SURFF賞、およびSTART賞、DKへのNSF CAREER賞2236996、およびNKDへのNIH補助金T32 GM066706によって支援されました。結晶学的研究は、ノースイースタン大学で行われた研究に基づいています。共同アクセス チーム ビームライン (24-ID-C および 24-ID-E)。国立衛生研究所から国立一般医科学研究所が資金提供しています (P30 GM124165)。 24-ID-E のアイガー 16 M 検出器は、NIH-ORIP HEI 助成金 (S10OD021527) によって資金提供されています。 この研究では、契約番号 DE-AC02-06CH11357 に基づいてアルゴンヌ国立研究所が DOE 科学局のために運営する米国エネルギー省 (DOE) 科学局ユーザー施設である高度光子源リソースを使用しました。 著者らは、データ収集中に技術的なアドバイスを提供してくれたアルゴンヌ国立研究所の高度光子源のスタッフに感謝したいと思います。 NMR と ITC の設備をご提供いただき、また原稿について建設的なコメントをいただきましたメリーランド大学ボルティモア郡の Michael Summers 教授に感謝いたします。

メリーランド大学ボルチモア郡化学生化学学部、ボルチモア、メリーランド州、21250、米国

ナバ・K・ダス、ネレ・M・ホルマン、ジェフ・フォークト、ハサン・A・バンナ、マンジュ・オジャ、ディーパック・コイララ

ハワード・ヒューズ医学研究所、メリーランド大学ボルチモア郡、ボルチモア、メリーランド州、21250、米国

ネレ・M・ホルマン

メリーランド大学医学部生化学および分子生物学部、ボルチモア、メリーランド州、21201、米国

スピリドン・E・セブダリス

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NKD と DK は実験を考案し、設計しました。 NKD はサンプルを準備し、ほとんどの実験を実施し、DKNMH の協力を得て NMR データを収集して分析し、結晶構造を解明しました。 JV はすべてのバイオインフォマティクスと計算作業を実行しました。 SS は初期の結晶化試験を設計および設定しました。 HAB と MO は、NKD の生化学実験と X 線回折データの収集を支援しました。 NKD は生化学および結晶学的データの大部分を分析し、その結果を DKNKD とともに解釈し、DK が原稿を執筆し、すべての著者が原稿を批判的にレビューしました。

ディーパック・コイララへの対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれたベンジャミン アキヤマと他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Das, NK、Hollmann, NM、Vogt, J. 他高度に保存されたエンテロウイルスの 5' クローバー葉 RNA 複製エレメントの結晶構造。 ナットコミューン 14、1955 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-37658-8

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受信日: 2022 年 7 月 28 日

受理日: 2023 年 3 月 23 日

公開日: 2023 年 4 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37658-8

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