結晶構造は、二重構造の触媒機構と制御機構を明らかにします。

Nature Communications volume 13、記事番号: 4880 (2022) この記事を引用

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E1 酵素 Uba6 は、アデニル化とチオエステル結合形成の連続触媒作用を含む 2 段階のプロセスでユビキチンとユビキチン様タンパク質 FAT10 を活性化することによってシグナル伝達を開始します。これらのプロセスの機構に関する洞察を得るために、我々はヒト Uba6/ユビキチン複合体の結晶構造を決定しました。複合体の 2 つの異なる構造が観察されます。1 つは、Uba6 がアデニル化の触媒作用のために構成された活性部位を持つ開構造をとるもので、もう 1 つは、アデニル化の活性部位が分解され、チオエステル結合形成の触媒作用のために再構成される、大きく異なる閉じた構造です。。驚くべきことに、イノシトール六リン酸（InsP6）分子は、Uba6 上のこれまで未確認のアロステリック部位に結合します。我々の構造的、生化学的、生物物理学的データは、InsP6 が Uba6 の開構造と閉構造の相互変換を変化させることにより、Uba6 活性をアロステリックに阻害すると同時にその安定性を向上させることを示しています。 Uba6による触媒作用とその活性のアロステリック制御の分子機構を明らかにすることに加えて、我々の構造は、Uba6特異的阻害剤を開発するための枠組みを提供し、天然に存在する細胞代謝産物による他のE1のアロステリック制御の可能性を高める。

ユビキチン (Ub) および Ub 様タンパク質 (Ubl) によるタンパク質の翻訳後修飾 (PTM) は、細胞周期制御、DNA 修復、シグナル伝達、免疫などの基本的な細胞プロセスの制御を支えています1。 Ub/Ubl の結合には、E1、E2、そしてほとんどの場合は E3 を含む酵素の並行カスケードの連続的な相互作用と活性が必要であり、これらの酵素が一緒になって Ub/Ubl を活性化し、シャトルし、標的タンパク質にライゲートします2。 2 つのヒト Ub E1、Uba1 と Uba6 は、ATP 加水分解 (アデニル化) と高エネルギー E1-Ub チオエステル結合の形成 (チオール化) を結びつけることにより、Ub 結合カスケードのゲートキーパーとして機能します。続いて、活性化された Ub が同族 E2 酵素の異なるレパートリーに移動します (チオエステル交換)3、4、5、6、7、8、9。 Uba1 は Ub 活性化に特異的ですが、Uba6 は Ub と FAT10 に対して二重の特異性を示します 5,8。後者は有糸分裂の進行 10、免疫 11、12、13、14 に関与する Ubl であり、癌にも関与します 15、16、17、18、19。、20、21。

Uba6 は現在まで構造的特徴付けができていないが、豊富な研究により、Uba1 が大きなマルチドメイン酵素であり、各ドメインが Ub アデニル化の触媒作用中に異なる機能的役割を果たすことが示されている 22,23、E1-Ub チオエステル結合形成 24,25,26、およびE1-E2-Ubトランスチオエステル化27、28、29、30。活性アデニル化ドメインと不活性アデニル化ドメイン (それぞれ AAD および IAD) は、Ub の初期リクルートに関与しており、Ub 活性化の最初のステップで Ub の C 末端をアデニル化するための触媒機構も担っています。 E1 Cysドメインは、第1および第2の触媒システインハーフドメイン(それぞれFCCHおよびSCCH)と呼ばれる2つの球状ハーフドメインとして配置されている。 FCCH ドメインは Ub 認識に役割を果たし、SCCH ドメインは Ub 活性化の第 2 段階での Ub チオエステル結合形成に関与する触媒システイン残基を保持します。最近の研究では、E1 がアデニル化とチオエステル結合の形成に必要な大きな立体構造変化を受けることが明らかになりました 24、25、31、32。 Uba125 および Ubl SUMO の E1 の研究では、アデニル化は「開いた」立体構造の E1 で起こり、チオエステル結合の形成には SCCH ドメインの約 130° 回転 (または「閉鎖」) が関与することが示されています。触媒システインを活性部位に輸送します31。最後に、ユビキチンフォールドドメイン (UFD) は、E2 の分子認識とその後の E1 から E2 触媒システインへの Ub の移動に関与しています 26、27、28、29、30。配列分析に基づいて、Uba6 は Uba1 と同様のドメイン構成を保持していると予測されます 5。しかし、構造データが存在しないため、Uba6 が Ub および FAT10 を活性化する分子機構は不明です。さらに、増殖中の哺乳動物細胞のほぼすべての Uba1 は活性化された Uba1~Ub 状態にありますが、Uba6 は同様の条件下で 50% のみ活性化されます 6,33。この違いの分子的根拠はまだ解明されていません。

ヒトの無数の細胞プロセスの調節において Ub 結合が果たす重要な役割を考慮すると、Ub 結合を担う酵素機構自体が、その機能の微調整と調節を可能にする複数層の調節機構の影響を受けることはおそらく驚くべきことではない 34 、35。複数の Ub/Ubl 経路で機能する E1、E2、および E3 酵素、および Ub/Ubls 基質自体は、リン酸化、アセチル化、脱アミド化、ADP リボシル化、ユビキチン化、SUMO 化、NEDD 化などの PTM によって制御されます 34,35。 PTM に加えて、いくつかの天然に存在する小分子が Ub/Ubl 経路を調節することが知られています。例えば、E3 Ub リガーゼの最大のファミリーのメンバーであるカリン RING E3 Ub リガーゼ (CRL) は、イノシトール六リン酸 (InsP6) および他のイノシトールリン酸によって負に制御されます 36、37、38、39。具体的には、CRL は COP9 シグナロソーム媒介デネジ化によって不活性化され、InsP6 は CRL/COP9 相互作用を促進する補因子として機能します 38,39。また、InsP6 および InsP5 は、植物 CRL の基質アダプターサブユニットである SCFTIR1 および SCFCOI1 と直接相互作用し、TIR1 および COI1 がそれぞれオーキシンおよびジャスモン酸受容体として機能するのをサポートする構造的役割を果たしていることが明らかになりました 36,37。 PTM および小分子を介した Ub シグナル伝達調節機構の発見の着実なペースと、Uba6 に焦点を当てた研究が相対的に少ないことを考慮すると、Uba6 の活性を支配する機構は依然として不明です。

Uba6 が Ub/FAT10 の活性化を触媒する分子基盤についての洞察を得るために、ヒト Uba6/Ub 複合体の 2.25 Å 結晶構造を決定しました。 Uba6/Ub 複合体は、2 つの大きく異なる立体構造で観察されます。1 つはアデニル化の準備が整っている開いた立体構造、もう 1 つはチオエステル結合の形成が準備されている閉じた複合体です。さらに、イノシトール六リン酸（InsP6）分子が、Uba6 SCCH ドメインに特有の進化的に保存された高度に塩基性のポケットに結合していることを観察しました。開いた立体構造での InsP6 との接触には、チオエステル結合形成中に再配列を受けるいくつかの残基および構造要素、および触媒作用に重要な残基が関与します。また、InsP6 が Uba6 の開構造と閉構造の相互変換を変化させることで Uba6 活性をアロステリックに阻害すると同時に、その安定性も向上させることも見出しました。まとめると、我々の研究は、Uba6 触媒活性の構造的基盤を明らかにし、Uba6 の特定の機構的特徴を利用する、天然に存在する細胞代謝産物によるアロステリック制御のユニークな機構を予期せぬ形で明らかにしました。

Uba6 が Ub/FAT10 を活性化する分子機構を解明するために、我々はヒト Uba6/Ub 複合体の結晶構造を決定しようとしました。アデニル化は触媒できるが、チオエステル結合形成（チオール化）は触媒できないヒトUba6のシステインからアラニンへの触媒的変異体（C625A）（図1a）を構造研究に使用して、サンプルの不均一性を低減し、結晶化を促進しました。昆虫細胞由来の組換えヒト Uba6C625A は、細菌での発現と比較してタンパク質収量が大幅に高かったため、構造研究に使用されました。結晶化試験を行う前に、ヒト Uba6C625A を Ub および ATP・Mg2+ と混合してアデニル化を促進し、非対称単位 (AU) に 2 つの複合体を含む回折品質の結晶が得られました。広範なスクリーニングと精製の後、ヒト Uba6C625A/Ub 複合体の構造は 2.25 Å の分解能で決定され、R/Rfree 値は 0.166/0.206 で優れた幾何学的形状でした (補足表 1)。 AU 内のヒト Uba6C625A/Ub 複合体の両方のコピーに由来する Ub は、Ub アデニル酸生成物と一致して、C 末端で強力かつ連続的な電子密度を示しました。対照的に、ピロリン酸（PPi）脱離基およびMg2+に対応する電子密度は存在しませんでした（補足図1a）。したがって、複合体は、PPI と Mg2+ の放出後のアデニル化の生成物複合体を表します。

a Uba6~Ub チオエステル形成反応の概略図。 b 開いた E1 構造の Uba6/Ub-AMP/InsP6 の結晶構造の漫画表示。 IAD ドメインはスレートです。 AAD はピンク色です。 FCCH はホットピンクです。 SCCH はマゼンタです。 UFD はオレンジ色です。 cys キャップはシアン色です。そして Ub(a) は金色です。触媒システインは黄色の球で示されています。 AMP と InsP6 は球で示されています。 c bのように提示された閉じたE1立体配座のhUba6 / Ub-AMPの結晶構造の漫画表示。斜線のボックスで示された無秩序な領域を有するUba6のドメイン構成の概略図をbとcの下部に示します。

注目すべきことに、結晶学的AUにおけるヒトUba6C625A/Ub-アデニレート複合体の2つのコピーは、互いに大きく異なる構造を示します（図1b、c）。 1 つのコピーでは、アデニル化活性部位は完全に規則的であり、SCCH ドメインは「開いた」立体構造を採用しており、触媒システイン (C625A) は、チオエステル結合中に求核攻撃を受ける Ub-AMP のグリシルリン酸結合から 35 Å 以上離れています。形成（図1b）。我々は今後、このヒトUba6C625A/Ub-アデニル酸複合体のアデニル化能力のある立体構造をUba6OPEN/Ub-AMPと呼ぶ。 AU 内の複合体のもう一方のコピーでは、アデニル化活性部位が部分的に分解され、SCCH ドメインは 136 度の剛体回転を示す「閉じた」立体配座をとります (Uba6OPEN/Ub-AMP に対して)。これにより、触媒システイン（C625A）のβ炭素がUb-AMPのグリシルリン酸結合から約4Åの位置に配置され、チオエステル結合形成に重要な追加の構造要素が活性部位に導入されます（図1c）。我々は今後、この複合体のチオール化能を有する立体構造を Uba6CLOSED/Ub-AMP と呼びます。さらに比較すると、Uba6CLOSED/Ub-AMP構造のUFDは、Uba6OPEN/Ub-AMP構造と比較して、SCCHドメインに向かって22°の剛体回転を受けることが示されています（図1b、c）。これらの構造変化により、UFD ドメインと SCCH ドメインの間の峡谷の長さが、Uba6OPEN/Ub-AMP 構造の約 35 Å から Uba6CLOSED/Ub-AMP 構造の約 24 Å に減少します（図 1c）。 Uba6OPEN/Ub-AMP構造におけるさらなる驚きは、SCCHドメインに位置するイノシトール六リン酸（InsP6）分子に対応する強い電子密度の存在でした（図1b）。最後に、Uba6OPEN/Ub-AMP 構造の触媒システインを閉塞する SCCH ドメイン内の規則的なループ領域 (「cys キャップ」と呼ばれる) が、Uba6CLOSED/Ub-AMP 構造で無秩序になります。観察された構造変化と InsP6 による結合がどのように Uba6 活性と機構的および機能的に関連するのかを以下で説明します。

全体として、Uba6/Ub 相互作用は Uba1/Ub22,23 の相互作用と似ており、Ub と FAT10 に対する Uba6 の二重特異性についての洞察を得るために、FAT10 (PDB: 6GF2)40 を Ub にドッキングすることにより Uba6/FAT10 モデルを作成しました。 Uba6/Ub 構造から（補足図 1d、e）。 Uba6 / FAT10モデルと配列分析により、FAT10はUba6と相互作用するUb位置で31％の同一性しか持たないことが明らかになりました（補足図1f）。 UbとFAT10の間の多くの分岐領域のうち、UbのIle44疎水性パッチ(Leu8/Ile44/Val70)は、Ub41のUba1活性化に重要であることが知られており、Uba6/Ubにおける同様の疎水性相互作用ネットワークに参加している。構造は FAT10 では保存されません (補足図 1d–f)。 FAT10 では、Ub Ile44 パッチに対応する領域が分岐してより極性が高く、Ser95、Thr132、および Ala159 で構成されています。したがって、Ub が Uba1 および Uba6 と参加する機能的に重要な疎水性接触の同じネットワークは、FAT10 では不可能です。 Uba6/Ub 構造で Uba6 と相互作用する他の多くの Ub 残基の違いに加えて、FAT10 は、Uba6 の AAD の近くにある β1-β2 ループに 2 残基の挿入を持ち、そこで独自の相互作用に関与している可能性があります (補足図1d〜f）と、特異性に役割を果たすC末端のユニークな「CYCI」モチーフ42。最後に、FAT10は、リンカー領域（補足図1e）によって接続された2つのタンデムUb様ドメイン（NTDおよびCTD）を保有しているという点でUbとは異なります。これは、かなり遠くに位置しているにもかかわらず、Uba640によるFAT10の活性化に重要であることが以前の研究で証明されています。酵素の表面から。正確には、前述の FAT10 CTD の違いが Uba6 への結合様式にどのように影響するか、NTD-CTD リンカーとおそらく NTD 自体が Uba6 結合にどのような役割を果たすのか、そしてこれらの違いが疎水性 Ile44 パッチの欠如を補う可能性があるのかどうか。 FAT10 では、Uba6/FAT10 構造の決定を待ちます。

SCCH ドメインは、2 つの柔軟なループによって Uba6 のアデニル化ドメインにつながれています。これらは、触媒システインを保持し、SCCHドメインの先頭につながるクロスオーバーループと、SCCHドメインをアデニル化ドメインに戻すリエントリーループと呼ばれます（図2a）。上で述べたように、SCCH ドメインは 136° 回転 (ドメイン交替とも呼ばれる) を受け、触媒システインをアデニル化活性部位に移行します。 SCCHドメインの変化には、残基Arg615からPro623の間のクロスオーバーループの屈曲と、残基Gly888からAla893の間のリエントリーループの直交屈曲が伴います（図2aおよび補足図2b）。 Uba6OPEN/Ub-AMP 構造では、触媒システインはクロスオーバーループ内の短いヘリックス (H18) 上に位置しますが、Uba6CLOSED/Ub-AMP 構造では、H18 が溶けて拡張ループになります。これにより、触媒システインがUb-AMPのグリシルリン酸結合の求核攻撃に向けられます（図2aおよび補足図1b）。チオール化のための触媒システインの位置を決めるクロスオーバーループの経路の変更は、Uba6CLOSED/Ub-AMP構造内の短いβ鎖ペア（β23-β24）の形成によって安定化されますが、β23-β24を構成する残基はUba6OPEN/Ub-AMP構造の柔軟なループ（図2a）。

a 開いた構造（アデニル化活性）と閉じた構造（チオエステル結合形成活性）における Uba6 SCCH ドメインの比較。アデニル化ドメイン (Uba6 の剛体として機能する) を重ね合わせ、SCCH ドメインを漫画として示し、触媒システインを球として示します。各 SCCH ドメインの構造状態間の回転の度合いが示されます。参照枠を提供するために、他の SCCH ドメインの立体構造状態における触媒システインの相対位置を半透明の黄色の円で示し、各パネルにそれに応じてラベルを付けます。 SCCH ドメインの選択されたヘリックスは標識され、その N 末端と C 末端はそれぞれ「nt」と「ct」で示されます。 b、c アデニル化からチオール化適格状態への移行中に構造変化を受ける Uba6OPEN/Ub-AMP/InsP6 (b、左、中央) および Uba6CLOSED/Ub-AMP (c、左、中央) 構造内の要素は、次のとおりです。色分けされラベルが付けられた漫画として示され、複合体の残りの部分は表面表現として示されます。 Uba6OPEN/Ub-AMP/InsP6 (b、右) および Uba6CLOSED/Ub-AMP (c、右) 活性部位の概要。アデニル酸中間体と接触する残基を棒で示します。水素結合は破線で示され、選択された水分子は赤い球で示されます。

SCCHドメインの変化に伴うUba6のクロスオーバーおよびリエントリーループ内の構造変化に加えて、Uba6のcysキャップ（残基798～817）は、Uba6OPEN/Ub-AMP構造の秩序状態からUba6CLOSED構造の無秩序状態に遷移します。 /Ub-AMP 構造 (図 2a)。 Uba6OPEN/Ub-AMP構造では、システインキャップがUba6触媒システインを埋めており（図2a、b）、活性を低下させる酸化的または化学的損傷からUba6を保護している可能性があります。 Uba6CLOSED/Ub-AMP構造では、SCCHドメインの交替により、cysキャップがアデニル化の触媒機構のすぐ近くまで通過します（図2cおよび補足図1c）。 cys キャップが Uba6OPEN/Ub-AMP 構造と同じ立体構造を採用した場合、深刻な立体衝突が発生する可能性があります。したがって、チオール化中の cys キャップの無秩序は 2 つの目的に役立ちます。1 つは、触媒システインの溶媒へのアクセス性を高め、それによってその反応性を高めること、2 つ目は、閉じた立体配座におけるアデニル化ドメインとの立体衝突を防ぐことで、SCCH ドメインの変化を促進することです。。

上で述べたように、Uba6OPEN/Ub-AMP 構造の活性部位は、PPi 脱離基と Mg2+ の放出後のアデニル化反応の Ub アデニル酸生成物を表します。 Ub アデニレートにおける Ub Gly76 と AMP 間のグリシルリン酸結合に関して、Ub の Gly76 のカルボニル酸素は、Gly469、Ala470、Ile471、Gly472 の主鎖窒素との直接および水を介した水素結合のネットワークに参加しています。 AMPリン酸（例：ATPのα-リン酸）は、Ala470、Arg508、およびGln509との直接水素結合に関与します（図2b）。アデニル化反応の基質複合体に近い、S. pombe Uba1 (PDB: 4II2) の構造に由来する ATP・Mg2+ の Uba6 活性部位への ATP・Mg2+ のドッキングは、Arg46 と Arg508 が ATP の γ-リン酸と相互作用する位置にあることを示しています。、Asp569は保存されたMg2+イオンを配位するように位置し、Asp499、Glu502、およびAsn505は2番目のMg2+イオンの配位に関与するように位置しています（補足図2a）。 Uba6CLOSED/Ub-AMP構造では、Ub Gly76のカルボニル酸素は、Uba6OPEN/Ub-AMP構造で観察されるのと同じ直接および水を介した水素結合のネットワークに参加しています（図2c）。 AMPリン酸は、Uba6 Ala470の骨格窒素との同等の水素結合に関与しており、ドメインの変化と活性部位のリモデリングの結果、Arg508およびGln509との接触を失いながら、Thr626との新しい水素結合を獲得しました（図2c）。最後に、Gly76の主鎖窒素、AMPのリン酸基およびアデニン基、およびUba6のAsp569、Asn570、およびLys628の間で、Uba6CLOSED/Ub-AMP構造に特有の水を介した水素結合のネットワークが発生します（図2c）。。

アデニル化に適した Uba6OPEN/Ub-AMP 構造とチオール化に適した Uba6CLOSED/Ub-AMP 構造を比較すると、アデニル化ドメイン内の広範な構造変化ネットワークが SCCH ドメインの変化と結合し、集合的に Uba6 活性部位を再構築する役割を果たしていることが明らかになりました。チオール化を触媒します（図2b、cおよび補足図2c）。注目すべきことに、いくつかの重要な触媒残基は、アデニル化適格状態からチオール化適格状態への移行中にリモデリングを受ける領域から生じている。これには、AADのアミノ酸499〜599（短い310ヘリックス、g6を保持しているため「g6領域」と呼ばれます）、およびIADのヘリックスH1（残基46〜51）が含まれます（図2cおよび補足図2c）。。 Uba6OPEN/Ub-AMP構造では、g6領域とH1が相互作用し、アデニル化の鍵となる残基を適切に配置するのに役立ち、SCCHドメインのオープン構造のプラットフォームとして機能します（図2b）。チオール化能のある Uba6CLOSED/Ub-AMP 構造では、AAD の g6 領域が展開して Ub アデニレートから AMP から離れて伸び、そこで SCCH ドメインと相互作用して閉じた立体構造を安定化し、H1 および H2 のヘリックスを形成します。 IADは、SCCHドメインとの衝突を避けるために、アクティブサイトからフリップアウトします（図2cおよび補足図2d）。これにより、Arg46、Glu502、Asn505、Arg508、Gln509 などのアデニル化に重要な残基が活性部位から置換され、チオエステル結合の形成に重要な残基と置換されます。

Uba6CLOSED/Ub-AMP構造では、C625A触媒性システイン変異体のβ炭素はGly76カルボニル炭素から4.5Å離れており、チオール化に必要な求核攻撃に備えています（図2a、cおよび補足図2c）。システインとしてモデル化すると、この距離は約 4 Å に短縮され、クロスオーバーループの経路をわずかに変更するだけで、γ 硫黄を反応性の適切な位置に配置できます。 Thr626はAMPのリン酸との水素結合に参加し、Lys628はアデニル化ドメインのAsp569との塩橋に関与し（図2c）、アデニル化の触媒作用中にMg2+を配位すると予測されます（補足図2a）。これらの 3 つの残基 (Cys625、Thr626、および Lys628) はすべて、Uba6OPEN/Ub-AMP 構造のヘリックス H18 内に存在し、Uba6CLOSED/Ub-AMP 構造におけるこのヘリックスの融解が活性部位リモデリングの重要な側面であることをさらに裏付けています。チオール化のためにこれらの残基を適切に配置するために必要です。

まとめると、我々の構造は、Uba6 がアデニル化とチオエステル結合の形成を触媒する分子機構について次のような洞察を提供します。 Uba6OPEN/Ub-AMP構造の活性部位内のアミノ酸の配置は、Ub Gly76のC末端カルボキシレートが、水素結合によるアデニル化の触媒作用および相互作用による電荷相補性によるATPのα-リン酸の求核攻撃のために調整されていることを示唆しています。 Uba6ヘリックスH14のN末端にGly469、Ala470、Ile471、Gly472を有する。 ATPは私たちの構造には存在しませんが、モデリングは、アデニル化の触媒作用中に、PPi脱離基が塩基性および極性残基であるArg46、Asn505、Arg508、Gln509、およびLys521によって安定化されることを示唆しています（補足図2a）。アデニル化中、求核攻撃中に反転を受けるα-リン酸を安定化することに加えて、Mg2+ は Ub Gly76 カルボキシレートと ATP の α-リン酸の間の静電反発を緩和すると考えられます。 PPi 脱離基が解放された後、SCCH ドメインの変化と活性部位のリモデリングにより、アデニル化の触媒機構が分解され、チオール化の触媒機構が再編成されます。これにより、反応が前進し、同時に逆反応（例：ATP と遊離 Ub の再形成）が防止されます。どちらの構造でも、Ub-AMP の Gly76 の α-リン酸と C 末端カルボニル酸素は、それぞれアデニル化とチオール化中に求核攻撃を受け、Uba6 のヘリックス H14 の N 末端を直接指しています。これは、ヘリックス双極子の電気陽性が、アデニル化とチオール化の両方の反応中に形成される遷移状態と四面体中間体の負電荷の安定化に役立つ可能性があることを示唆しています。

上で述べたように、我々の2.25Å Uba6OPEN/Ub-AMP構造では、H18およびUba6触媒システインに近いSCCHドメインの表面の深いポケット内に強い電子密度が観察されました（図3a〜e）。その六回対称性と周囲の化学環境に基づいて、この密度がInsP6の分子に対応するものであると特定しました（図3dおよび補足図3a）。この分子はタンパク質バッファーにも結晶化バッファーにも含まれていないため、昆虫細胞での発現後にタンパク質と一緒に精製されたに違いありません。電子密度は、2 位のリン酸がアキシャル、1、3、4、5、および 6 位のリン酸がエクアトリアルである椅子型配置の InsP6 の最も安定な形態である myo-InsP6 と一致しています。構造の分析により、InsP6分子は、ゼブラフィッシュからヒトまでほぼ完全に保存されているSCCHドメインの球状コア内の高度に塩基性のポケットに結合することが示される（Uba6は脊椎動物とウニに特異的であることに注意）（図3f）。 InsP6 の軸方向のリン酸は、Lys644、Lys706、Lys709、および Tyr710 との水素結合のネットワークに参加していますが、赤道側のリン酸は Ser647、Lys652、Lys687、Arg691、および Lys714 と接触しており、Trp640 は結合ポケットの組織化において構造的役割を果たしています (図3a、d)。

a – c ヒトUba6の開いた構造（a）、Uba6の閉じた構造（b）、およびUba1の構造（c）のSCCHドメインの表面静電表現。 Uba6 開構造の InsP6 との接触に関与する Uba6 残基と、Uba6 閉構造および Uba1 構造の対応する残基が標識されています。 Uba6 の開いた構造の規則的な cys キャップは漫画の色付きのシアンで示され、Uba6 の閉じた構造と Uba1 の無秩序な cys キャップはシアンの破線の円で示されます。 d Uba6 開放構造における InsP6 の複合省略密度マップ (1σ で等高線) を青いメッシュで示します。 InsP6 は、炭素 (緑)、酸素 (赤)、リン酸 (オレンジ) の付いた棒として示されています。 InsP6 と相互作用する残基は棒で示され、水素結合は点線で示されます。 e Uba6閉鎖構造内のInsP6結合ポケットの複合省略密度マップをdのように示します。 InsP6 は、Uba6 の開放構造に基づいてモデル化されています。 f Uba6 および Uba1 SCCH ドメインの InsP6 結合領域の構造に基づく配列アラインメント。 Uba6 の二次構造を上に示します。 InsP6 結合に重要な残基は黄色の星で強調表示されています。 g 示された Uba6 および Uba1 変異体と示されたイノシトールリン酸との間の相互作用に関する等温滴定熱量測定データ。実験は三重に行われ、上のパネルは生のパワーデータを示し、下のパネルはNanoAnalyzeソフトウェア（TA機器）を使用した標準結合方程式へのデータの適合を示します。図全体を通じて、「Apo」ラベルは大腸菌由来の物質を指します。

興味深いことに、Uba6のcysキャップとクロスオーバーループには、球状SCCHドメインの基本ポケットの外側に、InsP6への接触の大規模ネットワークに参加する残基が含まれています（図3a、d）。 cysキャップはInsP6分子を覆い、InsP6の3つのエクアトリアルリン酸との直接および水を介した接触に関与する2つの塩基性残基、Lys800およびLys810に寄与する（図3a、d）。さらに、Uba6 のクロスオーバーループ内のヘリックス H18 上の触媒システインの近くに位置する Lys628 も、InsP6 の 2 つの赤道側リン酸と接触します。特に、Cys キャップ、クロスオーバーループ、および InsP6 の間の接触ネットワークは、Uba6CLOSED/Ub-AMP 構造では発生できません。これは、SCCH ドメインの変更中およびアクティブ中に cys キャップが無秩序になり、クロスオーバーループが大幅に異なる経路をとるためです。チオール化を伴う部位のリモデリング (図 2a、c)。これと一致して、Uba6CLOSED / Ub-AMP構造のInsP6のアキシャルおよびエクアトリアルリン酸に対応する弱い電子密度のみが観察されるため、InsP6は最終モデルには含まれませんでした（図3e）。 InsP6をUba6CLOSED / Ub-AMP構造のSCCHドメインにドッキングすると、Uba6との主要な立体衝突がないことがわかり（補足図3b）、上記のデータと合わせて、閉じた立体構造におけるInsP6の低親和性結合部位が示唆されます。。

Uba6OPEN/Ub-AMP 構造における InsP6 との接触に関与する残基は、ウニからヒトまで 92 ～ 100% の同一性を示しますが、同じ比較により、この領域では Uba1 がヒト Uba6 と 8 ～ 25% の同一性しか示さないことが明らかになり、多くの残基が含まれています。荷電残基に関係する違い（図3f）。その結果、Uba1の同等の領域は、Uba6と比較して著しく異なる構造的特徴と表面静電特性を持ちます（図3c）。これは、InsP6 と相互作用する能力が、Uba1 ではなく Uba6 に特有の機能として進化したことを示唆しています。この仮説を検証するために、大腸菌を使用して Uba6 と Uba1 を精製し、等温滴定熱量測定 (ITC) を使用して InsP6 に対する親和性を測定しました。大腸菌を使用したのは、この生物がイノシトールリン酸またはイノシトールリン脂質を生成しないため、InsP6 がタンパク質と同時精製されないためです。結果は、細菌由来のUba6が約41nMのKDでInsP6に結合するのに対し、Uba1は同じ条件下で検出可能な結合を示さないことを示しています（図3g）。また、シグナル伝達イノシトールリン酸 InsP3 (D-myo-イノシトール 1,4,5-三リン酸) および InsP5 (D-myo-イノシトール 1,3,4,5,6-ペンタキスリン酸) に結合する Uba6 の能力もテストしました。これらは両方ともInsP6の前駆体であり、それぞれ248および73nMというより高いKD値であるにもかかわらず、Uba6とも相互作用できることがわかりました（図3g）。これは、InsP3 と InsP5 がそれぞれ InsP6 の結合に重要な軸方向リン酸を欠いていることと一致しています。重要なことに、Uba6のInsP6結合ポケットを含むUba6残基の、Uba1の対応するアミノ酸への変異（K644E/S648L/L702W/K706H/K709T/Y710Q；以下、Uba6_InsP6mutと呼ぶ）は、評価されたように、Uba6とInsP6の間の相互作用を完全に無効にする。 ITCを使用します（図3gおよび補足図3c）。総合すると、これらの結果は、InsP6 結合が Uba1 ではなく Uba6 に特異的な特徴であり、Uba6 の基本結合ポケットが InsP3 や InsP5 などの他のシグナル伝達イノシトールリン酸にも結合できることを示しています。最後に、InsP6 に対する Uba6 の高い親和性 (約 41 nM) と、真核細胞における InsP6 の細胞内濃度 10 ～ 100 μM の範囲 43,44 は、この結合が生理学的重要性を持つことを示唆しています。また、いくつかの精製ステップを経た後でも、昆虫細胞で発現された InsP6 と Uba6 の強力な同時精製についての説明も提供されます。

次に、50μM InsP6の存在下および非存在下でのUba6-UbおよびUba6-FAT10チオエステル結合形成に関する定常状態前の速度論パラメータを決定することにより、InsP6がUba6の活性を調節できるかどうかを調べた。この濃度は、文献で報告されている細胞濃度の中央値であるため選択されました。上述したように、大腸菌はInsP6を合成できないため、大腸菌由来のUba6をこれらのアッセイに使用した。興味深いことに、ミカエリス定数 (Km) は InsP6 の存在下と非存在下で Ub と FAT10 でほぼ同じですが、観察された Uba6~Ub および Uba6~FAT10 チオエステル中間体形成の速度定数 (kobs) は ~3 であることがわかりました。 InsP6の存在下では-4倍遅くなります（図4a、b、表1、および補足図4〜6）。注目すべきことに、昆虫細胞由来のUba6の速度論的パラメーターは、InsP6の存在下で大腸菌由来の材料と同様であり、昆虫細胞由来の材料中の共精製されたInsP6が同様に触媒活性を弱めることを示しています（図4a、図4a、 b および表 1)。

a、b Uba6~Ubl チオエステル活性アッセイにおける、InsP6 の存在下および非存在下での大腸菌由来 Uba6、および昆虫細胞由来 Uba6 の動態曲線。図全体を通じて、「Apo」ラベルは大腸菌由来の物質を指します。データは平均値 +/- SEM (n = 3 技術的反復) として表示されます。 c 示されたUba6およびUba1変異体のUb（左）およびFAT10（右）チオエステル形成活性のInsP6阻害に関するIC50曲線。データは平均値 +/- SEM (n = 3 技術的反復) として表示されます。 d 示されたUba6変異体のUba6〜Ub（上）およびUba6〜FAT10（下）チオエステル形成活性に対するInsP6および他のイノシトールポリリン酸の影響。アッセイは、100 μM InsPx(3、5、または 6) の存在下および非存在下で実施されました。データは平均値 +/- SEM (n = 3 技術的反復) として示され、WT 値のパーセンテージとして表示され、個々の反復は灰色の円で示されます。 e 100μM InsPx(3、5、または6)の存在下および非存在下でのサーマルシフトアッセイによって決定された、示されたSCCHドメイン変異体の融解温度。データは平均値 +/- SEM (n = 3 技術的反復) として示され、個々の反復は灰色の円で示されます。図 4a ～図 4e の基礎となるソースデータは、ソースデータファイルとして提供されます。

E1活性に対するInsP6の影響をさらに評価するために、0〜50μMの範囲のInsP6濃度で大腸菌で産生されたUba6_WT、Uba6_InsP6mut、およびUba1_WTを使用したE1〜UbおよびE1〜FAT10チオエステル形成アッセイを使用して用量反応実験を実施しました。結果は、InsP6がそれぞれ51および67 nMのIC50値でUba6〜UbおよびUba6〜FAT10を阻害することを示し（図4cおよび補足図7a）、ITC（41 nM）を使用して測定されたUba6 / InsP6相互作用のKDと一致しています。）。重要なことに、InsP6はUbとFAT10の両方のUba6_InsP6mut活性化を阻害できず、InsP6はUbのUba1活性化を阻害できませんでした（図4c）。これらの結果は、InsP6 の阻害効果が Uba6 に特異的であり、その SCCH ドメイン上の塩基性ポケットへの結合を介して媒介されることをさらに示しています。また、E1〜Ub / FAT10チオエステル形成アッセイを使用して、InsP3およびInsP5がUbおよびFAT10のUba6活性化を阻害する能力をテストしました（図4dおよび補足図7b）。これらのイノシトールリン酸は、InsP6と比較してUba6〜UbおよびUba6〜FAT10チオエステル中間体形成の阻害の大幅な減少を示します（図4d）。これは、InsP3とInsP5の両方が高い親和性（KD値248および73 nM）でUba6に結合することを考えると驚くべきことでした。、それぞれ;図3g)。この結果は、Uba6 活性の調節における InsP6 の軸方向リン酸の重要な役割を示しています。

次に、Uba6の全長およびスタンドアロンSCCHドメイン変異体の両方を使用して、イノシトールリン酸結合がUba6の安定性に影響を与えるかどうかを決定するために、サーマルシフトアッセイを実施しました（図4eおよび補足図8）。結果は、大腸菌由来のUba6 SCCHドメインにInsP6が結合すると、その融解温度が〜43℃から59℃に上昇し、昆虫細胞由来タンパク質の融解温度と同様であることを示しています（図4e）。 InsP3とInsP5は、大腸菌由来のUba6 SCCHドメインの融解温度をそれぞれ約43℃から47℃と54℃に上昇させますが、イノシトールリン酸は昆虫細胞由来タンパク質の安定性に影響を与えません（図4e）。最後に、イノシトールリン酸は大腸菌由来のUba6_InsP6mut SCCHドメインの熱安定性に影響を与えず（図4e）、これは再びUba6に対するイノシトールリン酸の調節活性がSCCHドメインの塩基性ポケットへの結合を介して媒介されることを示している。。 Uba6のマルチドメインの性質により融解曲線はより複雑ですが、Uba6 SCCHドメインについて上記で説明した傾向は、全長Uba6の状況でも同様です（補足図8）。

Uba6OPEN/Ub-AMP および Uba6CLOSED/Ub-AMP 構造の分析により、InsP6 の Uba6 への結合がその活性と安定性を調節する分子機構についての洞察が得られます。上で述べたように、Uba6OPEN/Ub-AMP 構造の InsP6 と相互作用する残基の多くは、無秩序になる (cys キャップ)、大幅に異なる立体構造をとる (クロスオーバーループと H18)、または大幅に異なる位置を占めるはずの Uba6 の領域内に位置しています。チオエステル結合形成の触媒作用のため、閉じた立体配座への移行中にSCCHドメインが変化するためです（図2a〜c）。これには、クロスオーバーループの Lys628、SCCH ドメインの Lys714、および cys キャップの Lys800 と Lys810 が含まれます。これらは一緒になって、Uba6OPEN/Ub-AMP 構造の InsP6 の赤道側リン酸との水素結合と塩橋の広範なネットワークに参加します (図5a、b)。 Uba6CLOSED/Ub-AMP構造では、InsP6へのこれらの接触はすべて失われ、代わりに、Lys628およびLys714が活性部位内のAsp569およびGlu502との塩橋に参加し、閉じた立体構造の安定化に寄与します（図5a、図5a、 b）。

a、b Uba6 の開いた構造 (a) および Uba6 の閉じた構造 (b) は、ループとして示されている SCCH ドメインを除き、表面表現として示されています。アデニル化からチオール化可能な状態への移行中に SCCH ドメインで構造変化を受ける要素が漫画として示されています。選択されたアミノ酸は球として表示されます。 InsP6 と AMP は棒で示されています。乱れた cys キャップはシアン色の円で示されます。 c 閉じた立体配座でモデル化された Uba6 開いた構造の SCCH ドメイン。開いたＳＣＣＨ（ループとして示される）は、表面表現として示されるＵｂａ６を有するＵｂａ６閉構造のＳＣＣＨドメイン上に重ね合わされた。 cys キャップ、Helix 18、クロスオーバーループ、および Uba6 によるリエントリーループを含む SCCH [オープン] の要素間の立体衝突は、赤い破線の四角形で強調表示されています。 d アデニル化とチオール化を分離し、チオール化活性を特異的に評価する Ub-AVSN 架橋アッセイにおける a および b に示されている Uba6 側鎖の構造機能分析 (左)。図全体を通して、「Apo」は大腸菌由来の物質を指します。 Ub-AVSN および Uba6-Ub-AVSN クロスリンクの概略図 (右)。 Uba6 との反応中に攻撃された求電子中心は黒星で示されています。データは平均値 +/- SEM (n = 3 技術的反復) として示され、WT 値のパーセンテージとして表示され、個々の反復は灰色の円で示されます。 e アデニル化とチオール化の両方を必要とするUba6~Ubチオール化アッセイにおけるaおよびbに示されているUba6側鎖の構造機能分析。データは平均値 +/- SEM (n = 3 技術的反復) として示され、WT 値のパーセンテージとして表示され、個々の反復は灰色の円で示されます。図５ｄ、ｅの基礎となるソースデータは、ソースデータファイルとして提供される。

これは、InsP6 の Uba6 への結合が、Uba6 の開いた立体構造を安定化することによってその活性を阻害し、それによってチオール化に必要な閉じた立体構造の形成を妨げるという仮説につながります。これは、触媒システインを覆うcysキャップのInsP6媒介の安定化を通じて起こり、閉構造で秩序のままであればアデニル化ドメインと衝突します（図5c）、およびクロスオーバーループ（H18を含む触媒システインを含む）の安定化によって起こります。触媒システインが活性部位から離れた立体構造をとります。この仮説と一致して、Uba6〜Ubチオエステル形成活性アッセイとUba6-Ub-AVSN架橋アッセイの両方において、Uba6のK628AおよびK714D変異体ではInsP6調節活性が大幅に減少していることがわかりました（図5dおよび補足図9a）。、b）。 Ub-AVSN45,46 は、アデニル化半反応をバイパスするように設計された求電子性ビニルスルホンアミドを保持しており、それにより、入ってくる E1 システイン求核試薬を共有結合的に捕捉することにより、チオール化半反応の読み取り値として特に機能します 25,31。さらに、K714D Uba6 / InsP6 相互作用の KD は、6' リン酸および長距離静電相互作用への水素結合の喪失と一致して、〜30 倍（41 nM から 1.45 μM）に増加しました（補足図 9c）。 InsP6 の 5' リン酸を使用します。また、我々の仮説と一致して、E502AおよびD569A変異体の両方は、Uba6-Ubチオエステル形成およびUba6-Ub-AVSN架橋アッセイの両方において活性の大幅な低下を示します（図5d）。

我々のデータを総合すると、InsP6 が：（1）SCCH ドメイン内の柔軟なループ（cys キャップ、クロスオーバーループ）の安定化、（2）オープン構造での SCCH ドメインの安定化、ひいては H1/H2 の剛直化、（3）ドメインの2つのローブを架橋することによる球状SCCHドメイン自体の安定化（図3a）。これにより、これらの特徴が集合的に、Uba6単独と比較してUba6 / InsP6複合体の熱安定性の大幅な増加に寄与するという仮説が得られます（図4eおよび補足図8）。実際、これは、大腸菌での発現と比較して、昆虫細胞で発現させた場合の組換えUba6の収率が著しく高いことを説明する可能性がある。

この原稿では、Uba6 の構造スナップショットを提示し、この酵素によってアデニル化とチオール化が触媒される分子機構を明らかにします。 Uba6OPEN/Ub-AMP 構造は、PPi/Mg2+ の放出後のアデニル化生成物複合体を表し、Uba6CLOSED/Ub-AMP 構造は、チオール化の触媒作用に備えた複合体を表します。開いた構造と閉じた構造を比較すると、SCCHドメインの変化と活性部位のリモデリングがアデニル化活性部位を分解し、触媒作用に重要な残基を活性部位に交換することによってチオール化反応のために再構成することが明らかになった。 Uba6 のヘリックス H14 は、アデニル化とチオエステル結合形成の両方の際に形成される遷移状態と四面体中間体を安定化するための相補的な正の静電ポテンシャルを提供することにより、活性部位のオキシアニオンホールを構成するように配置されています。

アデニル化およびチオール化の触媒作用の顕著な機構的特徴の多くは、Uba125 や SUMO31 の E1 などの他の E1 にも保存されていますが、我々の Uba6 の構造は、Uba6 の予期せぬユニークな特徴を明らかにしています。すなわち、InsP6 に結合する SCCH ドメイン上の高度に塩基性のポケットは、酵素の活性と安定性の両方を調節する働きをします。 InsP6結合部位が、SCCHドメイン変化および活性部位リモデリングにおいて重要な役割を果たす構造要素に近接していることは、InsP6がどのようにUba6活性を調節するかについての説明を提供する。我々のデータは、InsP6を介したUba6活性の低下は、アデニル化適格状態からチオール化適格状態への移行中に構造変化を受ける構造要素の安定化によるものであることを示唆している。興味深いことに、我々のデータは、これらの相互作用が同じメカニズムを通じて Uba6 の熱安定性に寄与していることを示唆しています。私たちの発見は、COH00032 と呼ばれるアロステリック SUMO E1 阻害剤の発見と類似しています。その結合部位は InsP6 と比較してまったく異なりますが、COH000 は、SCCH ドメインの変化と活性部位のリモデリングにとって重要な構造要素の近くにあるポケットにも結合し、これらの機構的特徴をその阻害メカニズムの一部として利用します 32。 COH000 の発見により、E1 酵素は天然に存在する細胞代謝産物によってアロステリックに制御されているのではないかという推測が生まれ、実際、InsP6 はその最初の例です。

特に、我々のデータは、Uba6 が他のイノシトールリン酸にも結合できることを示しています。これらには、ナノモルの親和性で結合するセカンドメッセンジャーInsP3およびInsP5が含まれますが、これらはInsP6ほどUba6の活性を阻害しません（図3g）。対照的に、myo-イノシトール（リン酸塩を欠いている）は検出可能な親和性で Uba6 と結合できません。原理的には、myo-イノシトールの連続的なリン酸化によって 63 個を超えるリン酸化 InsP を生成することができますが、イノシトールリン酸の多様性における信じられないほどの複雑さがどのように Uba6 機能と相互作用するのかはまだわかっていません 47,48。 Uba6と比較して、Uba1は、Uba6のイノシトールポリリン酸結合部位に対応する領域の構造と表面電荷分布がまったく異なり、イノシトールポリリン酸と検出可能なほど相互作用することができません（図3g）。イノシトールポリリン酸と相互作用する Uba6 の独特の能力が、細胞内に常に存在する Uba6 分子の半分だけが Ub/FAT10 で活性化されるのに対し、活性化された細胞内に存在するほぼすべての Uba1 分子と比較して、その根拠となっているのではないかと推測するのは興味深いものです。状態6、33。イノシトールリン酸と相互作用する、および/またはイノシトールリン酸によって調節されることが実証されている Ub/FAT10 シグナル伝達に関与する酵素の数は着実に増加しており、最初に実証された例は、植物およびヒトにおけるカリン RING E3 Ub リガーゼ機能の InsP5 および InsP6 調節です 36。 37、38、39。これは、異なる細胞プロセスを支配するイノシトールリン酸によって調節される Ub/FAT10 シグナル伝達軸のサブセットが存在する可能性を示唆しています。より広い観点から見ると、Ub/FAT10 経路は、イノシトールリン酸セカンドメッセンジャーとの高親和性相互作用によって調節されることが現在知られているいくつかのシグナル伝達経路の 1 つであり、これらの分子が細胞生物学において果たす役割を理解し始めたばかりであることを示唆しています 49 、50。

最後に、他の負に帯電した細胞代謝産物または高分子が、特定の細胞状況下で Uba6 の基本結合ポケットに関与する可能性があると推測するのは興味深いことです。

例えば、さまざまなリン酸化イノシトール頭部基を有するホスホイノシチドは、制御された方法でさまざまな細胞タンパク質と相互作用します。これらのリン酸化イノシトール頭部基は、InsP3、InsP4、InsP5、InsP6 などの可溶性イノシトールリン酸の前駆体として機能し、高い親和性で Uba6 に結合することが実証されました。これは、Uba6 が特定のホスホイノシチドと相互作用する能力があり、その活性と安定性を調節することに加えて、その細胞内局在を変化させる機構として機能する可能性があることを示唆しています。この点に関して、オートファジーにおける Uba6 とホスホイノシチドの両方の役割が報告されていることは注目に値します 51,52。同様に、この研究は、他の E1 が調節機構として他の天然に存在する細胞代謝産物に結合できる可能性を強化します。これと一致して、我々は以前に、リガンド結合ホットスポット (ホットスポット 3) であると予測される Uba1 の SCCH ドメインの表面上の小さなポケットを同定しました。 Uba1のホットスポット3の構造と静電気は、Uba6のInsP6結合部位とは異なります（図3a〜c）。したがって、この位置に結合する代謝産物または高分子は、イノシトールリン酸とは異なる構造的および物理化学的特性を有すると考えられます。

私たちの研究により、Uba6 がアデニル化とチオール化を触媒する分子機構が解明され、細胞代謝産物によって媒介される調節機構も予想外に明らかになりましたが、この酵素についてはまだ多くのことが解明されていません。これには、細胞内のUba6の機能の調節においてイノシトールリン酸の結合がどのような役割を果たすのか、また他の細胞因子もSCCHドメインの塩基性ポケットに結合してその活性を調節するのかどうかの解明が含まれる。さらなる疑問には、Ub と FAT10 の両方に対する Uba6 の二重特異性を支配する分子規則の定義、およびこれらの Ub/Ubl の Uba6 同族 E2 結合酵素 Ube2Z への移動機構の解明が含まれます。この点に関して、Uba6 の InsP6 結合部位は、その SCCH ドメインの予測される E2 結合表面と重複しており、InsP6 が E1-E2-Ub チオエステル交換において何らかの役割を果たしているかどうかを決定するのは興味深いことである。最後に、我々の Uba6/Ub-AMP 構造、特にヒト Uba1 活性部位との違いは、癌やその他の疾患の治療介入のために特にこの酵素を標的とする創薬努力の枠組みを提供するでしょう。

大腸菌発現のために、ヒト Uba6 残基 37 ～ 1052 をコードする DNA フラグメントを、N 末端 ULP1 切断可能な SMT3 タグを持つベクター pSMT3.2 の NdeI/NotI 部位にクローニングしました 53。ヒト Uba6 SCCH ドメイン (残基 615 ～ 892) またはヒト Uba1 SCCH ドメイン (残基 625 ～ 892) をコードする DNA フラグメントを合成し (Gene Universal)、N 末端 ULP1- を持つベクター pSMT3.4 の NdeI/NotI 部位に挿入しました。切断可能なSMT3タグ。ヒトユビキチンをコードする DNA 断片を、N 末端 TEV 切断可能な 6 × His タグとともにベクター pET29NTEV の NcoI/XhoI 部位に挿入しました。ヒトFAT10(C7T/C9T/C134L/C160S/C162S)40をコードするDNA断片を合成し、ベクターpGEX-6P1のBamHI/NotI部位に挿入した。 7 つのリジンがアルギニンに変異した小麦ユビキチン (UbK7R) は、以前に記載されているように調製されました 54。昆虫細胞発現のために、ヒト Uba6 残基 37 ～ 1052 をコードする DNA フラグメントを、N 末端 TEV 切断可能な 6x His タグを備えた pFastBac HTB の NcoI/NotI 部位にクローニングしました。触媒システインである Cys625 は、結晶化のためにアラニンに変異されました。ヒト Uba6 SCCH ドメイン (残基 615 ～ 892) をコードする DNA フラグメントを、N 末端 TEV 切断可能な 6x His タグとともに pFastBac HTB の BamH/NotI 部位にクローニングしました。すべての点突然変異は、PCR ベースの部位特異的突然変異誘発を使用して導入されました。すべての構築物と点突然変異は、補足表 2 に記載されているプライマーペアを使用して生成されました。

E. coli BL21 (DE3) Codon Plus 細胞 (Agilent; Cat. No. 230280) で発現したすべてのタンパク質は、以前に記載されているように生成されました 23。簡単に説明すると、大規模培養物をルリアブロス培地中で 37 °C で A600 OD 2.0 まで増殖させた後、1.5% エタノール (v/v) を添加したコールドショックのために氷浴に置きました。 30分後、イソプロピル-β-d-1-チオガラクチオシド（IPTG）を最終濃度0.1 mMで添加し、18℃で一晩振盪することによってタンパク質を誘導した。 Bac-to-Bac バキュロウイルス発現システムを使用して、昆虫細胞でヒト Uba6 を発現させました。高力価の組換えバキュロウイルスを使用して、Sf-900 II SFM 培地 (ThermoFisher) で培養した BTI-Tn-5B1-4 (Hi5) 細胞 (ThermoFisher Scientific、カタログ番号 B85502) を 2 × 106 細胞/ml の細胞密度で感染させました。科学的）。 48時間の感染後に細胞を回収し、さらに使用するまで-80℃で保存しました。

細菌細胞または昆虫細胞で発現した Uba6 細胞を遠心分離によって回収し、DNase およびリゾチームの存在下で溶解バッファー (20 mM トリス HCl pH 8.0、350 mM NaCl、20 mM イミダゾール、0.5 mM TCEP) 中で超音波処理によって溶解しました。細胞溶解物を 39,191 × g で 30 分間遠心分離し、上清を Ni-NTA 樹脂 (QIAGEN) に適用し、タンパク質をバッファー 20 mM Tris HCl pH 8.0、350 mM NaCl、250 mM イミダゾール、0.5 mM で溶出しました。 TCEP。 SMT3 タグは、ULP1 プロテアーゼを 1:2000 (w/w) の比率で添加し、4 °C で一晩インキュベートすることによって切断されました。 6X His タグは、TEV プロテアーゼを 1:100 (w/w) の比率で添加し、4 °C で一晩インキュベートすることによって切断されました。切断後、タンパク質をバッファー 20 mM Tris HCl pH 8.0、350 mM NaCl、0.5 mM TCEP を使用した Superdex 200 ゲル濾過 (GE Healthcare) に供し、その後、標的タンパク質をプールして MonoQ 陰イオン交換カラム (GE Healthcare) に供しました。）さらなる精製のために緩衝液（緩衝液Ａ：２０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８．０、５０ｍＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＴＣＥＰ；緩衝液Ｂ：２０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８．０、１０００ｍＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＴＣＥＰ）と混合した。 Uba6 SCCH ドメインおよび Uba1 SCCH ドメインは、Superdex 200 の代わりに Superdex 75 カラム (GE Healthcare) を使用したことを除いて、Uba6 について記載したように精製しました。 FAT10 は、GST アフィニティークロマトグラフィーおよび Superdex 75 ゲル濾過 (GE Healthcare) によって精製しました。ヒトユビキチンおよびコムギ UbK7R は、Ni-NTA アフィニティーおよび Superdex 75 ゲルろ過 (GE Healthcare) によって精製されました。精製後、タンパク質を 5 ～ 10 mg/ml に濃縮し、等分して液体窒素中で急速冷凍しました。

Ｕｂａ６Ｃ６２５Ａを、２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＴＣＥＰ中、最終濃度１１５μＭで上記のように精製した。小麦 UbK7R (230 μM)、MgCl2 (5 mM)、および ATP (1 mM) を、Intelli-Plate (Art Robbins Instruments) でのスパースマトリックススクリーニングの前に 18 °C で添加しました。 Uba6/Ub複合体の回折品質結晶は、1μlのタンパク質サンプルと1μlの結晶化緩衝液（100mM MES pH6.4、140mM NaF、15％PEG3350）を混合することによって成長させた。結晶を、３０％のＰＥＧ３３５０を添加した母液からなる凍結保護剤中の液体窒素中で瞬間凍結した。

単一の Uba6/Ub 結晶からの完全な X 線回折データセットは、Advanced Photon Source (イリノイ州アルゴンヌ)、NE-CAT ビームライン 22-ID-E で 2.25 Å の分解能で収集されました。すべてのデータは、HKL200055 を使用してインデックス付け、統合、およびスケーリングされました。この結晶は、単位胞寸法 a = 248.6 Å、b = 101.3 Å、c = 122.9 Å、α = 90°、β = 118°、γ = 90°の空間群 C2 に属し、非対称ごとに 2 つの hUba6/Ub 複合体を持ちます。ユニット。

プログラム Sculptor を使用して、H. sapiens Uba1 (PDB: 6DC6) の座標に基づいてヒト Uba6 のモデルを生成しました 23。次に、プログラム PHASER56 を使用して、Uba6 Sculptor モデルと小麦 Ub (PDB: 4II2) の個々のドメイン (AAD/IAD、FCCH、SCCH、および UFD ドメイン) の座標を使用して分子置換ソリューションを見つけました。モデルは、PHENIX57 と COOT58 を使用した改良と再構築の反復ラウンドにより、R/Rfree 値 0.166/0.206 まで改良されました。改良の最初のラウンドには、hUba6 と Ub の AAD/IAD、FCCH、SCCH、および UFD の剛体フィッティングが含まれていました。最初の精製ラウンドの後、AU の Ub の両方の分子の C 末端における強力かつ連続的な電子密度は Ub アデニル酸生成物と一致し、その後数回の追加精製後に AMP とグリシルリン酸結合が電子密度に組み込まれました。モデルの構築と改良のラウンド。 Uba6OPEN/Ub-AMP 構造では、密度と周囲の化学環境の 6 回対称性に基づいて、SCCH ドメイン上のポケット内に強い電子密度が観察され、これは InsP6 分子として割り当てられました。最終ラウンドの精製中に手動で密度に InsP6 を配置し、良好に精製しました。 Uba6CLOSED/Ub-AMP 構造では、InsP6 の軸方向リン酸に対応する位置を除いて、InsP6 の電子密度が著しく弱いため、InsP6 はモデル化されませんでした。

最終的な hUba6/Ub-AMP モデルには、Ub の両方のコピー (鎖 B および D) のアミノ酸 1 ～ 76、Uba6 のコピー A のアミノ酸 40 ～ 1050、およびコピー C のアミノ酸 59 ～ 798 および 819 ～ 1049 が含まれています。 Uba6の。このモデルには、B 鎖と D 鎖の Ub-AMP 中間体からの 2 つの AMP 分子、Uba6 鎖 A に結合した 1 つの InsP6 分子、および 846 個の水分子が含まれています。最終的なモデルは良好なジオメトリを持ち、ラマチャンドラン空間の優先領域、許可領域、および不許可領域にそれぞれ 97.1、2.7、および 0.2% の残基が含まれています。構造のすべての分子グラフィック表現は、PyMOL59 を使用して生成されました。構造のアラインメントは、CCP4 ソフトウェアスイート 60 のプログラム Superpose を使用して実行されました。

ＩＴＣ実験は、２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＴＣＥＰを含む緩衝液中、２５℃でＡｆｆｉｎｉｔｙＩＴＣ（ＴＡｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて実施した。 100 μM InsP3 (D-myo-イノシトール 1,4,5-三リン酸三アンモニウム塩、サンタクルーズ)、InsP5 (D-myo-イノシトール 1,3,4,5,6-ペンタキスリン酸五カリウム塩) のアリコート (各 2.5 μl) 、Ｅｎｚｏ）またはＩｎｓＰ６（フィチン酸ナトリウム塩水和物、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、Ｅ１タンパク質またはＵｂ１の１０μＭ全長またはＳＣＣＨドメインを含む細胞に注入した。 20 回の測定が行われ、データは NanoAnalyze (TA 機器) を使用して分析されました。各実験は３回ずつ実施した。

ゲルベースの E1 チオエステル形成アッセイは、100 nM E1、2.5 μM Ubl、5 mM MgCl2、500 μM ATP、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4 pH 7.4、5% グリセロールおよび 0.1 mM を使用して実行されました。室温 (RT) での TCEP。反応は ATP を添加することで開始し、非還元尿素 SDS-PAGE 緩衝液を添加することによって終了させ、4 ～ 12% NuPAGE Bis-Tris ゲル (Life Technologies)、150 V 一定で 60 分間処理しました。ゲルを Sypro Ruby (BioRad) で染色し、ChemiDoc MP (BioRad) で視覚化しました。データの定量化は、ImageJ 1.53 ソフトウェアの濃度測定を使用して実行し、Prism 7.0a (GraphPad) を使用して分析しました。濃度測定の測定値は、同じゲル上の対照 WT アッセイのパーセンテージとして正規化されました。データは、±標準偏差誤差バーを含む 3 回の技術的反復の平均として表されます。すべての生化学アッセイの代表的なゲルの未処理画像がソースデータファイルで提供されます。

すべての E1~Ubl 阻害アッセイは、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4 pH 7.4、および 5 mM MgCl2 で 5 分間室温で。続いて、ATPおよび対応するUblを、それぞれ最終濃度500および2.5μMまで添加した。反応を室温で 2 秒間インキュベートし、非還元尿素 SDS-PAGE バッファーを使用して停止させました。すべてのサンプルを SDS-PAGE に供し、同じゲル上で InsPx アッセイを行わずに濃度測定値を対照 WT のパーセンテージとして正規化した点を除き、E1~Ubl 活性化アッセイについて上記したように染色、可視化、および定量化しました。

E1 の野生型および変異体コンストラクトの Ub-AVSN への架橋は、100 nM E1、500 nM Ub-AVSN、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4 pH 7.4、5 を含む反応混合物中で実行されました。％グリセロールおよび０．５ｍＭＴＣＥＰを室温で１分間反応させ、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ緩衝液中で変性させた。 E1~Ubl活性化アッセイについて上述したように、サンプルをSDS-PAGEに供し、染色し、視覚化し、定量した。

製造業者の推奨に従って、CF488A マレイミド (Biotium) による UblCys0 の蛍光標識を実行しました。簡単に説明すると、50μM UblCys0を150μM CF488A色素と結合緩衝液(20mM HEPES pH 7.5、150mM NaCl、0.5mM TCEP)中室温で一晩インキュベートした。次いで、反応を5 mM DTTでクエンチし、希釈してNaClの濃度を50 mMに下げた。得られた混合物を EnrichS (BioRad) カラムに供し、直線勾配 (UbCF488A の場合、50 mM NH4Ac、pH 4.51、50 ～ 1000 mM NaCl; FAT10CF488A の場合、20 mM Bis-Tris、pH 6.5、50 ～ 1000) で溶出しました。 mM NaCl)。精製したUblCF488Aをプールし、濃縮した。

反応は、いくつかの変更を加えて、上記の E1-Ubl チオエステル形成と同様に実行されました。反応液には 100 nM E1、0.1 ～ 10 μM UblCF488A、5 mM MgCl2、500 μM ATP、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4 pH 7.4、5% グリセロールおよび 0.1 mM TCEP が含まれ、室温で 2 秒間反応温度（RT）。反応は ATP を添加することで開始し、非還元尿素 SDS-PAGE 緩衝液を添加することによって終了させ、4 ～ 12% NuPAGE Bis-Tris ゲル (Life Technologies)、150 V 一定で 60 分間処理しました。ゲルは、Alex488 チャンネルを備えた ChemiDoc MP (BioRad) で画像化されました。すべてのゲルは、ImageJ 1.53 ソフトウェアを使用してバンド強度を FAT10CF488A のナノモルに変換するための標準曲線を含むように、既知量の FAT10CF488A の段階希釈でイメージングし、データポイントを Michaelis にフィッティングすることによって Prism 7.0a (GraphPad) を使用して分析しました。メンテンモデル。各基質濃度からのサンプルを 3 回繰り返して実行しました。

反応には、さまざまな時点（0 ～室温 (RT) で 20 秒)。短い時間点 (25 ミリ秒、100 ミリ秒、500 ミリ秒、1 秒) では、反応は QFM-4000 急速急冷フロー装置で実行されました。反応を開始するために、シリンジ 1 内の E1 および ATP を含む溶液 20 μl を、シリンジ 2 内の UblCF488A を含む溶液 20 μl と室温で急速に混合し、その後、反応を 20 μl 1 N HCl/3 × 非水溶液でクエンチしました。尿素 SDS-PAGE ローディングバッファーを削減します。長い時点 (2 秒、5 秒、10 秒、20 秒) については、反応は手動で実行されました。反応はATPの添加により開始され、非還元尿素SDS-PAGEバッファーの添加により終了されました。Ｕｂａ６〜Ｕｂ１ＣＦ４８８Ａチオエステル形成のＫｍを推定するために、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、染色し、視覚化し、上記のように定量した。

ゲルベースの E1~Ubl 阻害アッセイは、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4 pH 7.4、および 5 mM MgCl2 を含む緩衝液中で、100 nM の指定 E1 を 0 ～ 50 μM InsP6 とインキュベートすることによって実行されました。室温で5分間。続いて、ATPおよび対応するUblを、それぞれ最終濃度500μMおよび2.5μMまで添加した。反応を室温で 2 秒間インキュベートし、非還元尿素 SDS-PAGE バッファーを使用して停止させました。 E1~Ubl活性化アッセイについて上述したように、サンプルをSDS-PAGEに供し、染色し、視覚化した。データの定量化は、ImageJ 1.53 ソフトウェアのデンシトメトリーを使用して実施し、Prism 7.0a (GraphPad) を使用して、データポイントを 3 パラメーターの対数 (阻害) 応答モデルに当てはめることによって分析しました。データは、±標準偏差誤差バーを含む 3 回の技術的反復の平均として表されます。すべての生化学アッセイの代表的なゲルの未処理画像がソースデータファイルで提供されます。

E1 タンパク質の全長または SCCH ドメイン 2 μg を、20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、0.25 mM TCEP 中の 5× SYPRO Orange 色素 (Thermo Fisher) と混合し、MicroAmp Fast 光学 96 ウェル反応プレート (ライフテクノロジーズ）。各サンプルは 3 回ずつ調製されました。 96 ウェルを MicroAmp Optical Adhesive Film (Life Technologies) で密閉し、その後 QuantStudio 3 qRT-RCR (Applied Biosystems) に配置しました。融解曲線法を実行しました。連続収集が選択されました。 25 °C 2 分、1.6 °C/秒。 0.05 °C/秒の上昇。 95℃ 2分データは、さらに融解曲線を構築し、Prism 7.0a (GraphPad) によって融解温度を決定するために保存されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

原子座標と構造因子は、アクセッションコード 7SOL でタンパク質データバンク (PDB) に保管されています。 PDB から使用され、以前に公開された構造データは以下にリストされています: PDB: 6DC6、PDB: 4II2、PDB: 6GF2。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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リファレンスをダウンロードする

著者らは、原稿を批判的に読んでくれた Patrick Sung と Miklos Bekes に感謝します。 X 線回折データは、アルゴンヌ国立研究所の高度光子源のビームライン NE-CAT 24-ID-E で収集されました。この研究は、国立衛生研究所から国立一般医学研究所によって資金提供されているノースイースタン共同アクセスチームのビームラインで実施された研究に基づいています（P30 GM124165）。 24-ID-E のアイガー 16M 検出器は、NIH-ORIP HEI 助成金 (S10OD021527) によって資金提供されています。この研究では、契約番号 DE-AC02-06CH11357 に基づいてアルゴンヌ国立研究所が DOE 科学局のために運営する米国エネルギー省 (DOE) 科学局ユーザー施設である Advanced Photon Source のリソースを使用しました。この出版物で報告された研究は、NIH R01 GM115568、R01 GM128731、および CPRIT RR200030 (SKO) によってサポートされました。この研究は、研究担当副学長室およびメイズがんセンター創薬および構造生物学共有リソースの支援により、サンアントニオにあるテキサス大学健康科学センターの施設内研究コアの一部である構造生物学コア施設のリソースを利用しました。 (NIH P30 CA054174)。構造生物学中核施設のリガク HyPix-6000HE 検出器、ユニバーサルゴニオメーター、および VariMax-VHF 光学機器は、NIH-ORIP SIG Grant S10OD030374 によって資金提供されています。この研究の内容は著者のみの責任であり、必ずしも NIH の公式見解を表すものではありません。

これらの著者は同様に貢献しました: Lingmin Yuan、Fei Gao。

生化学および構造生物学部、サンアントニオ大学テキサス健康科学センター、サンアントニオ、テキサス州、78229、米国

リンミン・ユアン、フェイ・ガオ、ゾンヤン・LV、ディガント・ナヤック、アニンディタ・ナヤック、プリシラ・ドス・サントス・ベリー、クリスティーン・E・カノ、リジア・ジア、エリザベス・V・ワスマス、ショーン・K・オルセン

研究開発部門、北京 IPE 臨床検査センター CO、北京、100176、中国

フェイ・ガオ

サウスカロライナ医科大学生化学・分子生物学部およびホリングスがんセンター、チャールストン、サウスカロライナ州、29425、米国

ナタリア・オレイニク、フィルデブス・カンス・アティルガン、ベシム教師

ジョンズ・ホプキンス大学医学部小児科、ボルチモア、メリーランド州、21287、米国

ケイトリン・M・ウィリアムズ

生化学および分子生物学部、サウスアラバマ大学、モービル、アラバマ州、36688、米国

クリストファー・デイヴィス

UbiQ Bio BV、サイエンスパーク 408、1098 XH、アムステルダム、オランダ

ファリド・エル・ウアリド

人間の腫瘍学および病因プログラム、メモリアルスローンケタリングがんセンター、ニューヨーク、ニューヨーク、10065、米国

エリザベス・V・ワマス

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

タンパク質の精製は、FG、LY、DN、AN、および PSBFEO で合成、精製、検証された活性ベースのプローブによって実行されました。構造実験と分析は FG、LY、ZL、SKOLY によって実施され、FG は生化学的および生物物理学的アッセイを実施しました。 EVW、KEC、LJ、FCA、BO、KMW、CD が実験計画とデータ解釈を支援しました。図と原稿は、LY、FG、および SKO によって、すべての著者からの意見をもとに作成されました。

ショーン・K・オルセンへの手紙。

FEO は、UbiQ Bio BV の共同創設者および株主として競合する金銭的利益を宣言します。他のすべての著者は、競合する利益を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

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転載と許可

Yuan、L.、Gao、F.、Lv、Z. 他結晶構造は、二重特異性ユビキチン/FAT10 E1 酵素 Uba6 の触媒および調節機構を明らかにします。 Nat Commun 13、4880 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32613-5

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受信日: 2022 年 3 月 20 日

受理日: 2022 年 8 月 8 日

公開日: 2022 年 8 月 19 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32613-5

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