DNA結晶自己に対するホリデージャンクション配列とダイナミクスの影響

Nature Communications volume 13、記事番号: 3112 (2022) この記事を引用

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分子種を正確に配置するために合理的に設計された結晶構造をプログラム可能に合成することは、ナノテクノロジーの基本的な目標であり、DNA はこれらの材料を構築するための最も著名な分子の 1 つとなっています。 特に、分岐 DNA 結合は 3D 格子の構築のための中心的な構成要素として使用されています。 ここでは、結晶学を使用して、36 個すべての不動ホリデイ ジャンクション配列が自己組織化 DNA 結晶に及ぼす影響を調べます。 この分野で確立されたパラダイムに反して、ほとんどの接合では結晶が生成されますが、一部の接合では解像度が向上したり、独特の結晶対称性が得られます。 予想外なことに、接合に隣接するシーケンスでさえも結晶集合体に重大な影響を及ぼします。 不動結合配列のうち 6 つは結晶化に完全に耐性があり、したがって「致命的」であると考えられます。分子動力学シミュレーションにより、これらの結合には結晶形成に重要な 2 つの別個のイオン結合部位が常に欠如していることが明らかになりました。 ここで詳述する構造とダイナミクスは、結晶と DNA ナノ構造の両方の将来の設計をより広範に知らせるために使用できる可能性があり、応用ナノエレクトロニクス、ナノフォトニクス、および結晶内での触媒作用の分子工学に潜在的な影響を与える可能性があります。

ナノスケール材料を正確に組織化するための、高度にカスタマイズ可能な 3D DNA ベースのアーキテクチャの製造は、1982 年にシーマンによって最初に概念化されました1。ナノ粒子への DNA リンカーの結合など、プログラム可能な自己集合を可能にするさまざまな方法論が開発されています ( NP) 表面 2、3。ユーザー定義のコロイド NP 結晶構成 4、5、6、7、8 を備えた 3D 格子の構築に使用されます。 DNA 折り紙 9 の出現により、ゲスト種をホストするためにカスタマイズ可能な幾何学形状を表示する 3D 折り紙格子とともに、ナノ粒子クラスター形状の 3D 超格子が説明されています 12。 「テンセグリティ」モチーフ 13 に基づいて合理的に設計された結晶は、設計された 4 アーム接合交差点と「スティッキー エンド」凝集力で自己集合し、ナノデバイスに変換できることも示されています 14。 最近、独特の結晶対称性、改善された分解能、そしてあるケースでは独特の接合ヌクレオチド配列を備えたいくつかのユニークなモチーフが報告されています 15、16、17、18。

3D DNA 結晶への 4 方向ジャンクションの応用は、遺伝子組換えに触発されました。これにより、ホリデイ ジャンクション (HJ) と呼ばれる不安定な分岐中間体が作成され、その後、細胞分裂中の組換えを促進するために動的再構成が行われます 19。 ホリデージャンクションは構造的に広範囲に特徴付けられており 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 、構造 DNA ナノテクノロジーにおいて合理的に設計されたナノスケールアセンブリおよびデバイスの重要なモチーフとして浮上しています 1,30 天然に存在する HJ は、スライド」して腕の長さを変える31,32。これは枝の移動33として知られるプロセスです。 しかし、分岐点に非対称配列を導入すると、接合部が効果的に固定化され、明確に定義されたナノ構造の構築に使用できるようになります 34。 さまざまな多分岐ジャンクションが採用されていますが 35、36、37、38、39、40、41、4 アーム HJ が依然として最も人気があります。

理論的には、不動配列の塩基対の組み合わせは 36 個あります。 「J1」は最も早く設計されたもので 42、43、「J10」が使用された 18 という 1 つの例外を除いて、ほぼもっぱら自己組織化 3D 結晶の構築に使用されてきました 13、15、16、17。 初期の研究の中には、理論的方法 44,45 または実験的方法 46,47 を使用して、スタック X ジャンクションのパッキングに対する配列の影響を調査したものもありますが、我々の知る限り、不動 HJ の体系的な研究は行われていません。 さらに、イオン濃度と HJ のオープン構造からスタック構造への転移との関係はよく知られています 20、25、48、49、50、51。 しかし、イオン結合能力に対する配列効果の研究は限られているため、結晶化と対称性に影響を与える構造パラメーターの解明が望ましい探索ルートとなっています。

この研究では、2 つの異なる設計システムで、36 個すべての固定 HJ 配列が DNA 結晶を形成する能力を徹底的に調べます。 私たちの研究により、不動の HJ の大部分が結晶化を可能にし、一部の HJ ではより高解像度の構造とさまざまな対称性が得られることが明らかになりました。 スクランブルステムシーケンスを使用して実証したように、対称性は分岐点からさらに離れたジャンクションアーム (ステム) のシーケンスにも非常に敏感です。 特有のイオン結合部位も、構造内の 2 つの保存された位置で観察されました。 溶液中の 36 個すべての HJ の分子動力学 (MD) シミュレーションを実行することにより、これらのサイトが結晶化にとって極めて重要であり、普遍的に非結晶化する「致命的」接合部は、この方法でイオンを結合する能力がゼロであることを示します。 サンプリングによって制限されていますが、この研究で使用されたモデリングは、自己組織化 DNA 結晶格子に関連する 36 個すべての不動 HJ の配列依存の柔軟性と溶媒効果の信頼できる全体像を提供します。 全体として、この研究は、さまざまな不動 HJ 配列、隣接配列の修飾、イオンを捕捉する接合部の能力が、多数のデザイナー DNA 構造にまたがる自己組織化システムの合理的設計にどのように大きく影響するかについて、厳密かつ完全な説明を提供します。

このレポートでは、3 つの別個の自己組織化 DNA 結晶系、つまり「4 × 5」15 および「4 × 6」16 設計 (総称して 4 × N システムと呼ばれます)、および「スクランブル」構造を備えた 3 番目の構築について説明します。 4 × 6 格子の配列バリアント。 自己集合は、3つの構成オリゴヌクレオチドによって媒介されました（図1a）：（S1）5または6塩基のいずれかの4つの配列反復を含みます。 (S2) 両方の (S1) に相補的な領域を含む 21 塩基で構成されます。 （S3）第 2 ジャンクション交差点を形成します（図 1b）。 各非対称ユニットは、各アームに 10 および 11 bp を含む HJ として、または 21 bp の線形二重鎖として定義できます (補足図 1)。 両方のバージョンを並行して解析し、合計 134 個の結晶構造が得られました (データ収集および精密化統計に関する補足表 1)。 結晶格子には、自己集合して 4xN 鎖でつながれた一連の 21 bp 二本鎖になる一連の結晶「ブロック」で構成される連続配列が含まれています。 HJ は各ユニットの中心となる基本コンポーネントとして機能し、完全な格子の最終的な組み立ては、各二重鎖の尾にある相補的な 2 塩基の粘着末端によって促進されます。 元の 4 × 6 の「隣接」シーケンスも反対側で変更され、下流シーケンスが結晶化挙動において果たす可能性のある役割を特定するために、独立して、または HJ シーケンス自体と連携して行われました。

a 3 つのオリゴヌクレオチドは、「スクランブル」配列バリアントとともに 2 つの自己組織化モチーフ (4 × 5 および 4 × 6) の結晶化を媒介します。 3D 結晶の代表的な例を示します。 b ホリデイ ジャンクションの構造はアセンブリの重要な構成要素であり、クロスオーバー鎖として機能する 2 つのオリゴヌクレオチド (S1; 赤) および (S3; 黄褐色) を使用する 4 つのアームが含まれており、S2 (緑) は 3 番目の「直鎖」として機能します。それぞれの側に相補鎖があります。 S1 の相補領域には、各クロスオーバーの前に各アームに 5 または 6 塩基 (N bp) が含まれており、その時点で連続する各アームで同一の配列が合計 4 回 (4×N) 繰り返され、その後再びシリーズが開始されます (4 ×5または4×6）。 その後、S1 は格子全体の足場ストランドとして機能します。 c 3D 組み立てを容易にする中央の建物「ブロック」。 S1 は、構造の中心にあるホリデイ ジャンクション (四角で囲まれた、半透明) で 4 つの 21 bp 二本鎖をつなぎます。 直鎖状の 21 塩基の ssDNA オリゴヌクレオチド (S2) は、各二本鎖の半分を構成し、各末端に隣接する第 2 クロスオーバー鎖 (S3) が付いています (四角で囲った部分)。 各二本鎖の末尾には 2 bp の相補的な「粘着末端」 (アスタリスク) があり、これらが凝集して連続 3D アレイを形成します。 d 鎖の「滑り」を防ぐために配列の非対称性が課され、36 個の固定化接合部が形成された代表的な塩基。 e 3 つの独特な対称性 (P3221、P32、および R3) は、各固定接合部の配列と協調して機能する 4×N 足場鎖によって決定されます。 f 36 個の不動ジャンクション シーケンスは、(b) に従って各鎖が色付けされたオープン ホリデイ ジャンクション形式で表されます。 対応する各鎖上のヌクレオチドは、(d) の色付きスキームに対応する各構成要素オリゴヌクレオチド上の配列位置で示されます。

ここでは、単一の固定異性体を考慮しながら、各システムで36個の不動HJのパネル（図1f）を作成することにより、接合配列空間をプローブして、J1以外の接合が結晶化可能であり、解像度の向上が得られる可能性があるかどうかを判断し、それらを特定しましたそれは致命的であることが判明しました。 配列は、各構成要素の接合鎖上で明示的に定義されています (すべての構成要素のオリゴヌクレオチド配列は補足データ 1 および補足表 2 にあります)、または 21 bp 二重鎖として定義されている場合 (図 1、補足図 2、および補足図) 3）。 接合部が致命的であることを最終的に確認するために、厳密なスクリーニング (補足表 3) を実行して、各配列を最終的に分類しました (技術的な詳細については、補足情報の「方法」を参照)。 得られた構造には、以下で詳細に説明する3つの異なる対称性（P3221、P32、およびR3）が含まれていました（図1e、補足図4）。

J1 接合配列を含む元の 4 × 5 構造は、おそらく中心成分鎖への巻き込み不足により、構造的に歪んだアレイをもたらしました 15。 層状モチーフは、解像度 3.1 Å で明確に定義された足場を提供しましたが、キャビティの非周期性と対応する体積は、ゲスト材料の足場としては不十分です。 私たちは、接合角度にわずかな摂動をもたらす他のユニークな固定シーケンスを導入することで、元の系の歪みを潜在的に軽減し、「緩和された」周期格子を生成できる可能性があると仮説を立てました。

4 × 5 システムは接合部の 75% で堅牢に結晶化し、36 シーケンスのうち 9 を除くすべてで結晶が得られました (補足図 5 および補足表 4)。 接合部 J2 および J30 は結晶化しましたが、構造の解決には不十分な品質であったため、致命的として分類されました。 得られた構造のうち、18 個は平均セル寸法 a = b = 68.85 Å c = 60.09 Å の P32 対称性を示し、9 個だけが平均セルエッジ a = b = 68.17 Å c = 60.60 Å で元の P3221 対称性を保持していました (補足表 5) ）。 2つの対称性間のセルパラメータは事実上区別できませんでしたが（図2a、補足図6）、格子の周期性の違いは劇的であり、キャビティサイズが大きく異なります（図2b、c）。 J1 システムで達成された最高分解能は 3.1 Å でしたが、測定した結晶の約半分では分解能が 3.05 Å 以上で、P32 および P3221 の対称性では 2.9 Å (J6) および 2.75 Å (J19) にも達しました。 、それぞれ（補足表6）。

a P3221 対称性と P32 対称性を含む J5 (黄褐色) と J3 (赤色) の 4 × 5 ジャンクションの重ね合わせ構造。 接合部のアラインメントの全体的な RMSD 値は 1.34 で、計算された二重鎖間角度はそれぞれ 58.18° および 55.20°でした。 顕著な視覚的な違いは明らかではありません。 ただし、角度のわずかな違いでも全体的な充填に影響を与える可能性があることは、(b、c) で明らかです。 b かなりのサイズのゲスト分子の足場には適さない、非周期的な空洞配列を含む完全な J5 P3221 (4 × 5) 格子のスナップショット。 2 つの独自のサイズのキャビティが黒いボックスで示されています。 それぞれのキャビティの幅が示されています。 各キャビティは二本鎖の断面の長さ (約 2.0 nm) に及びます。 各方向での測定値を含む格子の代替ビューは、補足図8に含まれています。c完全なJ3 P32（4×5）格子のスナップショットは、（b）のJ5対応物と比較して、大きな周期的空洞の劇的に異なる配列を明らかにしています。 単一のキャビティは、幅 4.0 nm のブラック ボックスで強調表示され、二重鎖の断面の長さ (約 2.0 nm) にも及びます。 各方向の測定値を含む格子の代替ビューが補足図8に含まれています。

P3221 格子の空洞容積は、単位胞の平均 c 軸に対応する、三角柱の高さ 6.1 nm の結晶の 3 回対称軸に沿った細孔の 3 nm エッジに基づいて計算されました (補足図7)。 非周期格子には、幅1.0 nmと1.7 nmの空洞が交互の間隔で含まれており、約24 nm3の非常に小さな細孔容積が得られました（図2b、補足図7a）。 P32チャネルは、各エッジに沿って6.4 nmの六角柱として処理され、平均c軸= 6.0 nmとともに各ブロックの上部から底部まで測定された高さ（補足図7b）、結果の体積は~639 nm3、P3221 格子と比較してキャビティ サイズがほぼ 27 倍増加。 各対称タイプのジャンクション PDB 座標がグループ化され、その角度が DSSR52 で分析されました。 グループ内のすべての接合部の平均角度は、P32 と P3221 でそれぞれ 56.05° (σ = 1.63) と 56.59° (σ = 1.50) でした (補足表 7)。 私たちは、接合角度の小さな違いでさえ、格子の組み立てに大きな全体的な影響を及ぼし、それによって P3221 格子内の歪み​​を除去できると仮説を立てています。

並行して、以前に報告された P32 対称性を持つ J1 4 × 6 システム (3.05 Å) を採用しました16。 36 個のジャンクション配列すべてがスクリーニングされ、一貫して致命的なジャンクションが特定されました。 36 個の接合部のうち 17 個が結晶化に成功し、成功率は 47% でした (補足図 8 および補足表 8)。 4 × 5 モチーフとは異なり、ほぼすべての 4 × 6 ジャンクション配列は 2.0 M 以上の塩 (LiCl、Li2SO4、KCl、NaCl など) を含む緩衝液中での結晶化を強く好み、そのほとんどがわずかに塩基性の pH 条件を好みます。カコジル酸中（補足表9）。 解像度には目立った改善は見られませんでした。 ただし、5 つのケース (J4、5、31、33、および 36) では、接合によって対称性が三方晶系 (P32) から菱面体晶系 (R3) に変化しました。 さらに、J4およびJ36はR3のみで結晶化しましたが、J5、31、33はP32とR3の両方で結晶化する能力を示しました（補足図9）。 これらのシナリオでは、R3は低濃度の二価イオンと有機溶媒を好み、P32は格子が大きく異なる高塩（補足表10）を必要としました（補足図10）。 4 × 5 システムで結晶を生成しなかった接合部と比較した場合、6 つ (J11、12、13、17、18、および 27) の接合部が一貫して致命的であることが証明され (補足表 11)、これらの配列が可能性があることを示唆しています。将来の設計決定においては賢明でない選択肢と考えられます。

P32 結晶の平均セル定数は、a = b = 68.29 Å c = 55.68 Å でした。 特に、c 軸は、4 × 5 モチーフを使用して結晶化したものよりも約 5 Å 短く、ばらつきの度合いがはるかに大きかった (σ = 1.97) (補足表 12)。 短軸の範囲は 52.77 から 60.36 Å に及び、柔軟な軸長が 4 × 5 システムよりも多くの接合を致命的にする原因となっている可能性があると考えられます。 R3 対称性を含む結晶では、それぞれの平均セルは a = b = 114.9 Å c = 49.77 Å で、c 軸はより厳密な領域 (σ = 0.75) に限定されています。 キャビティ容積も、より高密度に充填されたR3構造の〜532.1 nm3と比較して、P32キャビティ容積（〜614.7 nm3）とは著しく異なりました（計算の詳細については補足図11を参照）。 P32 対称性と R3 対称性のそれぞれ 54.60° (σ = 1.44) と 58.37° (σ = 2.3) の平均接合角 (補足表 13) と、塩または有機溶媒の好みが主な要因であった可能性があります。それにより発散格子が得られました。

4 × 6 システムでは 17 個の接合部のうち 5 個で R3 対称性が得られたため、接合部に隣接する下流の配列が結晶化効率、接合角、および対称性の優先性に役割を果たすことができるかどうか、または HJ のみが特異な決定要因であるかを検討しました。 この可能性を調査するために、各「ステム」に沿って、GC含有量を維持しながら、標的塩基置換を備えた「スクランブル」配列（補足図12）を設計しました（図3a、b）。 天然Ｐ３２結晶で観察された緩衝液の好みとは対照的に、スクランブルシステムは、天然Ｒ３結晶と同様に、低塩緩衝液に対して排他的な好みを示した（補足図１３および補足表１４）。 注目すべきことに、J1とJ2のみがP32対称性を保持し、他のすべてはR3格子を生成しました（補足表15）。 また、J1 と J2 (P32) は、R3 システムと同様に、元の P32 結晶とは異なり、低塩条件を好む傾向があったことも注目に値します。 このバッファーの優先順位の変化は、グローバル配列の内容が実際に自己集合挙動に影響を与える可能性があることを示唆しています。 さらに、解像度のわずかな向上が観察され、J36 では 2.7 Å に達しました。 注目すべきことに、元の対応物と比較して結晶化を妨げるすべての接合は致命的なままであり（補足表16）、すべての相対的なキャビティの寸法と体積は乱されないままでした（補足図14および15）。

P32 対称性を持つ元の 4 × 6 配列モチーフ (灰色) と、R3 対称性を含むスクランブル配列バージョン (青緑色) を使用した J10 ジャンクション構造の重ね合わせの立体図。 改変された配列は、元の 4 × 6 配列バージョンと同じ GC 含有量を含む 2 つの下流ステム (1 および 2; 表示) 領域内に位置していました。 ジャンクションの形状に対するスクランブル シーケンスの効果は、重ね合わせたステム 1 および 2 領域を比較すると視覚的に明らかです。 接合角度の劇的な違いと、その対称性への影響は明らかです (補足図 15)。 b (a) の重ね合わされた J10 構造のスティック表示の立体図。4 × 6 J10 構造のオリジナルとスクランブル配列バージョンの間のすべての塩基修飾部位がステム 1 および 2 に示されています。アスタリスクは、修飾されたステム配列によって引き起こされる角度の明らかな結果として、顕著に分岐する粘着末端領域。 原子は、炭素 (青緑)、窒素 (青)、酸素 (赤)、およびリン酸塩 (オレンジ) を使用して示されます。 同一の配列を含むすべての領域は半透明のままになります。

接合角に対する長距離シーケンス効果の役割は依然として未解決の問題ですが、私たちの結晶系における効果は重要です。 ネイティブ 4 × 6 シーケンス (補足表 12) と比較して、R3 スクランブル結晶 (a = b = 113.04 c = 51.10; 補足表 17) の平均セル長にはわずかな差があるように見えます (補足表 12): a、b軸は約 2 Å 短くなり、c は約 1.3 Å 長くなる傾向がありましたが、J1 および J2 の場合、結晶は元の 4 × 6 モチーフとよく一致していました。 R3 結晶と P32 結晶の平均角度は、それぞれ 61.00° (σ = 1.21) と 58.05° (σ = 1.39) でした。 R3 結晶の平均角度はネイティブ シーケンスの平均角度よりも 3°近く高いですが (補足表 18)、スクランブル シーケンスの角度は、ネイティブ 4 × 6 構造で計算された小さい角度よりも大きなサンプル サイズから計算されます (58.37 °)、標準偏差が大幅に大きくなります (2.33)。 対照的に、P32 結晶の計算された角度は 54.60° (n = 16、σ = 1.44) と比較して 58.05° (n = 2、σ = 1.39) であり、サンプル サイズが小さいため平均精度が低くなりました。 54.60° は 4 × 6 システムで観察された平均角度をより正確に反映していると仮定します。

我々は以前に、結晶化バッファーに含まれるカコジル酸に起因して、接合部の2つの対向する位置（Pos1および2、補足図16および17）にヒ素イオンが存在することを報告しました15（図4）。 多くの場合、Pos2 に隣接する副溝内でイオンのクラスター化 (Pos3; 補足図 17) も観察されましたが、接合部との明らかな相互作用は共有されませんでした。 Pos1 と 2 は、モチーフや対称性に明らかな関係なく、かなりの数の構造におけるこれらの保存部位のいずれかまたは両方の電子密度マップで容易に観察できました (図 4)。 ほとんどの場合、設計パラメーターに関係なく、個々の接合部は 6.0 ～ 6.5 の pH 領域内のカコジル酸中で結晶化することが優先されますが、すべての結晶がこの要件に限定されるわけではありません。 4 × 5 システムでは、J25 と J34 は両方とも P32 対称性を示し、それぞれコバルトヘキサミン (CoH18N6) と 10 mM MgCl2 を含む 50 mM Tris pH = 8.0 緩衝液、および 20 mM MgCl2 を含む 50 mM HEPES pH = 7.5 で結晶化しました。 J25 の Fo-Fc マップのさまざまなピークの原因となるのはコバルトだけでしたが、J34、4 × 6 および 4 × 6 スクランブル システムの J22 と J23 にはそれぞれ Mg2+ が含まれていました。 モデル化されたイオンは容易に重ね合わせることができ、Pos1 および 2 でよく調整されました (補足図 18)。

4 × 5 システムで J21 を使用した立体図。クロスオーバー領域の塩基を占める 2Fo-Fc 電子密度は σ = 2.0 で等高線化され、個々のイオン位置 1 と 2 (Pos1 と Pos2 で示す) は独立して等高線化されます。 σ = 4.0 での対応する電子密度。 これらの部位でのヒ素の存在は、結晶を TAE-Mg2+ (40 mM Tris、20 mM 酢酸、および 1 mM EDTA pH = 8.6) に移し、その後結晶を凍結することによって実証されました。 対応するヒ酸ピークが存在するヒ素の K エッジ (λ = 1.04 Å) で結晶をスキャンしました。 結晶化バッファー内の他の成分は、対応する部位のイオンの Fo-Fc 差分マップで生じるピークを説明できません。 原子は、炭素 (灰色)、窒素 (青色)、酸素 (赤色)、リン酸塩 (オレンジ色)、およびヒ素イオン (緑色の球) を使用して示されます。

溶液中でのダイナミクスを調査し、結晶化接合部と非結晶化接合部の特性を比較するために、36 個すべての固定 HJ に対して全原子 MD シミュレーションが実行されました (完全な技術的詳細については、補足情報の「方法」セクションを参照してください)。 224 μs を超えるシミュレーションでは、我々の結晶学的実験や以前の研究と一致して安定した塩基対形成と B 型らせんトポロジーが観察されたため、力場の性能は満足のいくものであると考えられました 28,53,54,55。 シミュレーションにより、36 個の固定 HJ 間のらせん間力学における比較的小さな違いが明らかになりました。 角度の中央値と角度母集団のヒストグラムをそれぞれ補足表19と補足図18に示します。 らせん間角度はマイクロ秒のタイムスケールで急速に変動し、溶液中での HJ の立体構造の自由度の向上を反映しています。 その中央値は通常、この研究で報告された自己組織化 DNA 結晶で見られる値よりも低く、シミュレーション値が報告された値とより一致しているため、おそらくそれぞれの環境 (結晶格子対自由溶液) の真の影響を反映していると考えられます。孤立した HJ の X 線構造について。 それでも、大部分の HJ では、その差は 5° 未満でした。 最も異常な螺旋間角度の値と分布が J11 接合と J18 接合で観察され、どちらも結晶化しなかったことに注目します。 格子構造と両立しない過度の螺旋間力学および角度優先性は、これら 2 つの特定の接合の結晶成長阻害に寄与する要因である可能性があります。

MD シミュレーションで観察された個々の接合間の最も重要な違いは、接合分岐点付近に明確なカリウム イオン結合部位を形成する能力でした。 すべての場合において、イオンは分岐点のすぐ上のリン酸塩と最も近い 1 つまたは 2 つの塩基の間に架橋を形成しました。 これらのサイトは、実験的な結晶構造で観察されたPos1およびPos2サイトとよく一致しました（図4および5a）。 分岐点塩基対の塩基原子がイオン配位に関与しているため、イオン結合部位は 36 個の固定 HJ 間で大きく異なりました。 最も明白で顕著な違いは、私たちの実験では決して結晶化しなかった HJ (J11、12、13、18、および 27) は、シミュレーションにおいてこれらの特定のイオン結合サイトを形成する能力を一貫して示さないものでもあったということでした。 J17 も結晶化しませんでしたが、すべてのシミュレーション フレームのごくわずかな部分 (0.02%) で結晶化しました (図 5b)。 他のすべての HJ は、実験では結晶化し、シミュレーションではこれらのイオン結合サイトをある程度形成しました (図 5b)。 非致命的結合における結合の平均発生率は 0.53 (σ = 0.28) であり、イオンを捕捉する能力が不動 HJ を結晶化する能力にとって極めて重要であることを示唆しています。 我々は、分岐点のイオン結合部位が格子形成中の DNA 鎖交換を安定化し、結晶成長を促進しているのではないかと推測しています。 この仮説は、このイオン結合部位を形成できない接合、または形成の程度が低い接合は、結果的に結晶をまったく成長させないか、または結晶化に対してより敏感な接合の中に含まれるという事実によって裏付けられています。条件。 唯一の例外は J7 で、適切な分岐点配列を持っていたにもかかわらず、シミュレーションや実験ではイオン結合部位を形成しませんでしたが、それでも結晶化することができました。

a 4 × 5 J10 結晶構造 (半透明の灰色) と溶液中の J10 シミュレーションのスナップショット (黄褐色) を重ね合わせた構造。 分岐点付近の結晶構造内のヒ素結合サイト (緑色の球) は、溶液構造シミュレーションで自然に形成されたカリウム (青色の球) 結合サイトと重なっています。 b 36 個すべての接合シーケンスのシミュレーションにおける分岐点付近のイオン捕獲の発生率を示すグラフ。 コンセンサス「致命的」ジャンクション (J11、12、13、17、18、および 27) は、結晶化ジャンクションと比較して無視できる程度の J17 (アスタリスク) を除き、イオン捕捉能力を示しません。 結晶をもたらす他のすべての接合は、単一の異常値 (J7、ダイヤモンド) のみを除き、かなりの程度までイオンを捕捉する能力を示しました。 J7 は堅牢に結晶化しましたが、実験とシミュレーションの両方でイオンを捕捉する能力を示さなかったことから、この単一接合の結晶化にはイオン結合が必須ではないことが示唆されました。

最初は、シミュレーションで K+ カチオンが局在化している領域で、実験的に検出されたカコジル酸アニオンからのヒ素の存在に関連する明らかな矛盾がある可能性があります (図 5)。 ただし、これらの観察は調整できると考えられます。 我々の知る限り、多様な独立グループによって報告された PDB データベース内の HJ の実験構造はすべて、陽イオン (例、Na+、Mg2+、Sr2+、Ba2+) がこの位置に結合するはずであることを示唆しています。 この結果は、ここで計算された非常に負の分子相互作用ポテンシャル（補足図20）と一致しており、これはカチオン結合部位の特徴です。 ただし、ここで報告される結晶構造の大部分では、結晶化溶液中にカコジル酸ナトリウムが存在するため、カコジル酸アニオンは実際にX線構造の電子密度マップに最もよく適合します（補足図21）。 他の緩衝コンポーネントは、接合部自体とこの位置で妥当な接触距離を形成できません。 このヒ素に関する包括的な実験的証拠の完全な説明は、以前の研究で説明されています15。 この一見直感に反する結果は、いくつかの方法で合理化できます。 まず、カコジル酸は水素結合と溶媒との相互作用によってこの部位で安定化される可能性があり、その両方が負の表面電位を持つ領域でもアニオン結合を安定化させることが知られています 57,58 。 第二に、この部位にはカコジル酸と結合した (連鎖した) 1 つ以上のナトリウム対イオンが存在する可能性があります。 カコジル酸アニオンは、この方法で核酸の負に帯電したセグメントと相互作用を形成することが知られています59,60。 最後に、陰イオンの周囲に複数の Na+ イオン (カコジル酸の対イオン) が存在する可能性があります。 私たちの構造の公称分解能は約 3 Å の範囲であるため、相互作用する種をすべて明確に同定することはできません。また、水分子や Na+ の関与など、正確な配位を完全に記述することもできません。 。 Na+ の結合は、カコジル酸の負電荷を補償または過剰補償する可能性があり、シミュレーションやその他の実験構造で見られる一般的なカチオン結合部位を効果的に再作成できます。 Na+ イオンはしばしば変動し、その配位要件は柔軟であるため、私たちにはまったく見えません。 さらに、シミュレーションによって示唆されているように、平均化によって密度を曖昧にする重大な局所的なダイナミクスが存在する可能性があります。 過去の MD シミュレーションでは、核酸周囲の固いものから動的なものまで非常に多様な Na+ 結合部位が報告されており 61、目に見えない Na+ カチオンがカコジル酸アニオンと DNA のカルボニル基およびリン酸基を架橋できる可能性は十分にあります。 相互作用部位をより詳細に説明できないことが現在の研究の限界であるが、この位置でのイオンの収容が接合を安定させ、効果的に結晶化させるための厳密な要件であることは十分に明らかである。

この研究では、2 つの異なる結晶系にわたる 36 個すべての不動 HJ 配列の体系的な研究を報告しました。この研究結果は、原則として、あらゆる 3D DNA 結晶および潜在的に他のタイプの DNA 構造に拡張することができます。 我々は、J1 (または他の接合) が自己組織化格子を設計するための特権的なオプションとみなされるべきではないことを示します。 むしろ、ここで説明する他の多数のシーケンスの組み合わせを検討する必要があり、その多くは優れたパフォーマンスを提供する可能性があります。 我々は、J11、12、13、17、18、および 27 を含むいくつかの接合は結晶化にとって普遍的に致命的であり、おそらく代替異性体が考慮されない限り、将来の結晶設計では避けるべきであるという重要な観察を行っています。 もう 1 つの主な観察は、HJ の外側のステム領域配列の重要性です。この配列が結晶の対称性と格子構造を制御し、非自明な方法で解像度を向上させることができるためです。 また、これらの効果を促進する上でのイオン配位の重要な役割も解明しました。 DNA ナノ構造をより大きなアセンブリ (DNA 結晶、1D および 2D 格子、および潜在的に DNA 折り紙システム) にスケールアップするには、ステムと HJ ジオメトリの両方のレベルで配列依存の効果を考慮する必要があると思われます。 最後に、接合の MD 研究から得られた角度分布は、粗視化モデルと DNA ナノテクノロジー設計ツールの精度を向上させ、ナノ構造をより正確に表現することができます。

要約すると、我々の実験結果は、これまでに HJ で実行された最大規模の MD (集合体 224 μs) シミュレーションによって裏付けられています。 シミュレーションにより、HJ 立体構造に対する配列依存の柔軟性と溶媒の影響の役割が明らかになりました。 この研究は、HJ 配列が DNA 結晶の形成能力に重要な役割を果たしており、結晶の対称性に劇的な影響を与える可能性があることも示しています。 さらに、36 個すべての接合部を使用した自己組織化 DNA 結晶系に関する系統的かつ包括的な配列構造研究を提供しました。 最後に、この研究では、実験パラメータとモデリングパラメータの両方を使用して、この規模ではこれまでに行われたことのない特定の分子相互作用 (イオン結合) が予期せず明らかになりました。

すべてのオリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies (アイオワ州コーラルビル) から購入し、14% 変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (PAGE) または HPLC を使用して精製しました。 精製後、ペレット化した DNA をナノピュア H2O に再懸濁し、3 kDa 分子量カットオフフィルター (Amicon) を使用して 5 回洗浄して、残留塩を除去しました。 3 成分鎖 (S1:S2:S3) のストックを、各コンストラクトの最終濃度 30:120:120 μM で作成しました。 シッティングドロップ蒸気拡散法は、48条件の疎マトリックスを含む商用ベンダー（Sigma Aldrich）からの中止されたDNA結晶化スクリーニングの適応を使用して、Cryschemプレート（Hampton Research）で実行されました（補足表3）。 対応する各条件の 500 μL を各リザーバーに添加し、最終滴濃度 30 μM の DNA ストックと対応リザーバー溶液の 2:1 比の混合物を含む合計滴量 6 μL を調製しました。 結晶化が困難な接合部については、DNA 濃度、緩衝液の pH、塩濃度、アニーリング時間などの条件を変化させて、48 条件の疎マトリックス スクリーニング (補足表 3) を使用して複数ラウンドのスクリーニングを実行し、信頼性の高い測定を可能にしました。ジャンクションの有効性。 次に、プレートを冷却インキュベーター (Torrey Pines Scientific、カリフォルニア州カールスバッド) に置き、60 °C で 1 時間平衡させた後、直線勾配を使用して 0.3 °C/h の速度で 25 °C まで冷却しました。 。 得られた結晶は光学顕微鏡を使用して画像化され（補足図6、9、10）、その後、液滴に直接添加することにより30％グリセロールを補充した人工母を使用して凍結保護されました。 続いて、クライオループ（Hampton Research）を使用して結晶を回収し、液体窒素浴に直ちに浸漬することによって極低温冷却した。 すべてのデータは、補足表 1 に示されている対応するビームラインで窒素冷気流 (100 K) 中で収集されました。

すべての回折データは HKL200062 で処理され、PHENIX64 一連のプログラムからの Phaser63 での分子置換を使用して、それぞれ J1 4 × 5 構造 5KEK および 6X8C を二重鎖構造と接合構造の初期検索モデルとして初期位相を計算しました。 、およびその系で P32 対称性を含む二重鎖および接合構造の J1 4 × 6 構造 5VY6 および 6XNA をそれぞれ示します。 ただし、いくつかの例外を除いて、4 × 6 R3 対称結晶の大部分は、理想的な検索モデルとして対応するものの 1 つの別の R3 モデルを必要としました。 モデル構築の複数ラウンドが Coot で実行され、初期モデルは最初に単一の剛体として扱われ、その後、CCP466 の REFMAC65 の拘束リファインメントと実空間、および phenix.refine での XYZ 座標計算を使用した反復ラウンドが続きました。 すべてのイオンは、等高線レベル ≥ σ = 3.0 の Fo-Fc 差密度の領域にモデル化され、洗練されました。 その後、原子占有率と B ファクターの計算が改良され、さらに改良を完了するためのシミュレートされたアニーリングが行われました。 すべての洗練されたモデルでは、各構造に固有の反射の 5 ～ 10% を含む Rfree セットが使用されました。 合計 134 個の固有の構造の座標と構造因子はタンパク質データ バンク (PDB) に寄託されており、対応するアクセッション コードは補足表 20 にリストされています。データ収集と精製統計はすべて補足表 1 にまとめられており、次のように分割されています。それぞれの結晶系に。 このレポートに含まれるすべての本文および補足情報の構造図は、PyMOL67 を使用して作成されました。

我々は、すべてのシミュレーションの開始構造として、4 × 5 格子構造 (PDB:5KEK)15 で結晶化された接合 J1 の構造を使用しました。 HJ の各アームは少なくとも 8 つの塩基対を含むように延長され、ヘリックスの延長部分は結晶格子の隣接するセルから取られました。 得られた構築物は 64 ヌクレオチドを含み、分岐点の塩基対を適宜置換することにより、36 個すべての固定結合配列のシミュレーションの初期構造として使用されました。 AMBER1868のxLeapモジュールを使用してトポロジと座標ファイルを準備しました。 最新の AMBER OL15 DNA 力場 69 が、報告されたすべてのシミュレーションで使用されました。 改訂中に、HJ のサブセットに対して代替の parmbsc1 DNA 力場 70 もテストしました。 ただし、bsc1 を使用すると、非ネイティブでおそらく偽の β/γ g + /t バックボーン立体配座のかなりの集団が検出されました (補足図 22 および付属のテキスト (補足説明 1) を参照)。この観察は最近の報告とも一致しています 71。したがって、現在のシステムでは、OL15 力場が最適な選択である可能性があることを提案します。各 HJ 構造は、溶質とボックスの境界間の最小距離 16 Å で、SPC/E 水分子 72 の八面体ボックス内に溶媒和されました (補足図) . 23). 0.15 M の塩濃度は、KCl イオンの添加によって確立されました 73. その後、相対的なイオンの位置が結晶構造内のイオン サイトと比較されました. MD 条件とイオン結合の説明は実験条件と同一ではありませんが, シミュレーションは、イオン結合部位を形成するさまざまな配列の相対的な全体的な傾向を非常に現実的に反映しているはずです。次に、製造前の平衡化と各システムの最小化を実行しました。 最初の最小化は、DNA に 25 kcal/mol/Å2 の位置拘束を加えて実行し、続いて同じ位置拘束を使用してシステムを 10 ps のタイムスケールで 100 K から 300 K に加熱する平衡化実行を実行しました。 次に、5、4、3、2、1、そして最後に 0.5 kcal/mol/Å2 の位置拘束を DNA に加えて、一連の 6 回の最小化と平衡化の実行が続きました。 各最小化は、最急降下法を使用した 500 ステップと、それに続く共役勾配法を使用した 500 ステップで構成されました。 最初の平衡を除く各平衡は 5 ps で実行されました。 J1 以外のすべての接合部については、分岐点塩基対の初期形状を最適化するために、最初に追加の最小化ステップが実行されました。 生産シミュレーションは、周期境界条件と NPT アンサンブル、および標準シミュレーション プロトコル 75 を使用して、pmemd.cuda74 で実行されました。 各シミュレーションの長さは 1 μs で、36 個の接合すべてに対して 4 つの独立したシミュレーションが実行されました。 次に、選択された HJ のシミュレーションを 20 μs まで延長して、収束を検証しました (補足図 24a、b)。 解析は、cpptraj と VMD76、77 を使用して、個々のジャンクションの組み合わせシミュレーション アンサンブルを使用して実行されました。 シミュレーションにおける接合部の螺旋間角度は、Watson et al.56 によって以前に説明された定義に従って、Jtwist パラメータとして測定されました。この定義では、接合部の積層螺旋アームの 2 つの螺旋軸がベクトルで表され、Jtwist がそのドットとして計算されます。アングル品。 私たちのシミュレーションでは、右手ジャンクションと左手ジャンクションの間の遷移をサンプリングしましたが、ワトソンらによって割り当てられた同じ Jtwist 値を持つことに注意してください。 2004 年の定義。 利き手を区別するために、接合分岐点に垂直な追加ベクトルを定義し、それを使用して、らせん軸を表す 2 つのベクトルの外積ベクトルとのドット角度積を計算しました。 次に、この 2 番目のドット角度の値を使用して、ジャンクションの利き手を区別し、90° を超える値と下回る値がそれぞれ右巻きと左巻きのジャンクションに対応します。 その後、左手構造の Jtwist 値は -1 で正規化されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究で生成されたすべての座標と構造因子は、次のアクセッション コード (4 × 5 二重構造: J1-5KEK、J3-6WQG、J5-6WRB、J6-6X8B、J7-6WSN、 J8-6WSO、J9-6WSP、J10-6WSQ、J14-6WSR、J15-6WSS、J16-6WST、J19-6WSU、J20-6WSV、J21-6WSW、J22-6WSX、J23-6WSY、J24-6WSZ、J25- 6WT0、J26-6WRJ、J28-6WRI、J29-6WT1、J31-6WRC、4 × 5 ジャンクション構造: J1-6X8C、J3-6XDV、J5-6XDW、J6-6XDX、J7-6XDY、J8-6XDZ、J9- 6XEI、J10-6XEJ、J14-6XEK、J15-6XEL、J16-6XEM、J19-6XFC、J20-6XFD、J21-6XFE、J22-6XFF、J23-6XFG、J24-6XFW、J25-6XGM、J26-6XFX、 J28-6XFY、J29-6XFZ、J31-6XG0、J32-6XGJ、J33-6XGN、J34-6XGO、J35-6XGK、J36-6XGL、P32 対称の 4×6 二重構造: J1-5VY6、J2-7JPB、J5 -7JPA、J7-7JPC、J8-7JP9、J10-7JP8、J16-7JP7、J20-7JP6、J22-7JP5、J23-7JON、J24-7JOL、J26-7JOK、J28-7JOJ、J30-7JOI、J31-7JOH 、J33-7JOG; P32 対称の 4 × 6 接合構造: J1-6XNA、J2-7JFT、J5-7JFU、J7-7JFV、J8-6XO5、J10-7JFW、J16-7JFX、J20-7JH8、J22-7JH9、 J23-7JHA、J24-7JHB、J26-7JHC、J28-6XO6、j30-6XO7、J31-6XO8、J33-6XO9; R3 対称の 4 × 6 二重構造: J4-7JRY、J5-7JRZ、J31-7JS0、J33-7JS1、J36-7JS2。 R3 対称の 4 × 6 接合構造: J4-7JHR、J5-7JHS、J31-7JHT、J33-7JHU、J36-7JHV。 4×6 スクランブル二重構造: J1-7JKD、J2-7JKE、J3-7JKG、J5-7JKH、J7-7JKI、J8-7JKJ、J10-7JKK、J14-7JL9、J16-7JLA、J19-7JLB、J21-7JLC 、J22-7JLD、J23-7JLE、J24-7JLF、J26-7JNJ、J30-7JSB、J31-7JSC、J33-7JNK、J34-7JNL、J36-7JNM。 4×6スクランブルジャンクション構造：J1-7JK0、J2-7JJZ、J3-7JJY、J5-7JJX、J7-7JJW、J8-7JJ6、J10-7JJ5、J14-7JJ4、J16-7JJ3、J19-7JJ2、J21-7JIQ 、J22-7JIP、J23-7JIO、J24-7JIN、J26-7JIM、J30-7JI9、J31-7JI8、J33-7JI7、J34-7JI6、J36-7JI5）。 さらに、対応するすべてのアクセッション コードは補足表 20 にあります。この研究で生成された MD シミュレーション データの入力ファイルと出力ファイルは、アクセッション コード 6381939 で Zenodo データベースに保管されています。生の MD シミュレーション軌跡データは、以下から入手できます。データセットのサイズが大きいため、リクエストが発生します。

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このレポートに示されている結果は、アルゴンヌ光子源 (APS)、先進光源 (ALS)、およびナショナル シンクロトロン光源 II (NSLS-II) で行われた研究に基づいています。 高度光子源 (SBC-CAT) の ANL 構造生物学センター (SBC) は、契約 DE-AC02-06CH11357 に基づき、米国エネルギー省 (DOE) 生物環境研究局のために UChicago Argonne, LLC によって運営されています。 バークレー構造生物学センターは、ハワード ヒューズ医学研究所によって部分的に支援されています。 ALS は、契約番号 DE-AC02-05CH11231 に基づく DOE 科学局ユーザー施設です。 ALS-ENABLE ビームラインは、NIH、国立一般医科学研究所 (NIGMS) の助成金 P30 GM124169 によって部分的にサポートされています。 NSLS-II のビームライン AMX (17-ID) および FMX (17-BM) の結果。NSLS-II は、契約番号 DE-SC0012704 に基づいてブルックヘブン国立研究所によって DOE 科学局のために運営されている DOE 科学局ユーザー施設です。 ライフ サイエンス生物医学技術研究リソースは、主に NIH、生物医学技術研究リソース P41 助成金 (P41GM111244) を通じた NIGMS、国立科学財団材料研究部門 (NSF2004250)、および DOE 生物環境研究局 (KP1605010) によって支援されています。 ）。 この作業は SYMBIT reg プロジェクトによって部分的にサポートされました。 番号 CZ.02.1.01/0.0/0.0/15_003/0000477 は ERDF (MK および JS) によって資金提供され、21-23718S はチェコ科学財団 (MK および JS) によって資金提供されました。 NS はアリゾナ州立大学からのスタートアップ資金を認めています。 HY、NS、および PS は、米国科学財団材料研究部門 (NSF2004250) からの支援に感謝します。 HY はさらに、アリゾナ州立大学の大統領戦略イニシアチブ基金からも支援を受けました。

これらの著者は同様に貢献しました: Chad R. Simmons、Tara MacCulloch。

アリゾナ州立大学、分子設計およびバイオミメティクスのバイオデザインセンター、1001S。 McAllister Ave、テンピ、アリゾナ州、85287、米国

チャド・R・シモンズ、タラ・マカロック、マイケル・マッティス、アレックス・バックバーガー、イリッサ・クロフォード、ペトル・シュルク、ニコラス・ステファノプロス、ハオ・ヤン

アリゾナ州立大学分子科学部、テンピ、アリゾナ州、85287、米国

タラ・マカロック、アレックス・バックバーガー、イリッサ・クロフォード、ペトル・シュルク、ニコラス・ステファノプロス、ハオ・ヤン

チェコ科学アカデミー生物物理研究所、Královopolská 135、612 65、ブルノ、チェコ共和国

ミロスラフ・クレプル & イジー・シュポネル

先端技術および材料地域センター、チェコ先端技術研究研究所 (CATRIN)、パラッキー大学オロモウツ、Slechtitelu 241/27,783 71、オロモウツ、チェコ共和国

ミロスラフ・クレプル & イジー・シュポネル

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CRS と HY がこのプロジェクトを発案しました。 TM、AB、および IF は、CRS および NS の指示の下、すべての DNA を精製し、研究に使用されるすべての結晶を調製しました。CRS は、すべての結晶学的データ分析と構造解析と精製を実行しました。 MK、JS、および PS がすべての分子動力学シミュレーション実験を考案し、シミュレーション データの解析は MK によって実行されました。すべての接合角度の実験解析は、PS の指示の下、MM によって実行されました。著者全員が結果について議論し、原稿のフィードバックを提供しました、CRS と TM がすべての図を作成し、CRS、MK、NS、および HY が論文を執筆しました。

ニコラス・ステファノプロスまたはハオ・ヤンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Vlasis Mavrantzas と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

シモンズ、CR、マッカロック、T.、クレプル、M. 他。 DNA結晶の自己集合に対するホリデイジャンクション配列とダイナミクスの影響。 Nat Commun 13、3112 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-30779-6

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受信日: 2021 年 10 月 27 日

受理日: 2022 年 5 月 4 日

公開日: 2022 年 6 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30779-6

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