尿路結石症におけるメタボロミクスの応用: コハク酸塩の発見と使用

Signal Transduction and Targeted Therapy volume 8、記事番号: 41 (2023) この記事を引用

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11 オルトメトリック

メトリクスの詳細

尿路結石は、症候性の結石イベントによって中断される慢性代謝障害として概念化されています。結石形成中のシュウ酸カルシウム一水和物（COM）の発生は、結晶成長調整剤によって制御されることが示されています。結晶化阻害剤は数十年にわたって治療法として認識されてきましたが、結石症に介入する効果的な調整剤の発見に関しては限られた進歩しかありませんでした。この研究では、膀胱結石モデルにおける動的進行の尿成分をスクリーニングすることでバイオマーカーを同定する強力なアプローチであるメタボロミクス技術を使用しました。メタボロミクスデータの詳細なマイニングと分析により、5 つの異なる代謝産物をスクリーニングしました。密度汎関数理論の研究とバルク結晶化を通じて、それらのうちの 3 つ (サリチル酸、ゲンチシン酸、コハク酸) が in vitro で核形成を効果的に阻害できることを発見しました。そこで我々は、腎結石に対するEG誘発ラットモデルを用いて阻害剤の影響を評価した。特に、トリカルボン酸回路の重要な役割を担うコハク酸塩は、モデルにおける腎臓のカルシウム沈着と損傷を減少させる可能性があります。さらに、トランスクリプトーム分析により、コハク酸塩の保護効果は主に抗炎症、細胞接着および骨形成分化の阻害によるものであることが示されました。これらの発見は、コハク酸塩が尿路結石の新しい治療選択肢を提供する可能性があることを示しました。

尿路結石症は、比較的典型的な泌尿器科疾患であり、過去数十年にわたって世界中で罹患率が増加し続けています1。また、5年再発率が50%にも達する疾患でもあります2。尿路結石症の病因は複雑で、次のような要因が影響している可能性があります。肥満、糖尿病、高血圧、メタボリックシンドローム。3 シュウ酸カルシウム（CaOx）結石が尿路結石の 75% 以上を占め、続いて尿酸、リン酸カルシウム、ストルバイト、シスチンのタイプが続きます。4 尿路結石は多段階のプロセスです。根底にあるメカニズムはまだ完全には理解されていませんが、結晶の核形成、成長、凝集が関与しています。5 尿路結石症をどのように抑制し、その潜在的なリスクを予測するかは依然として大きな課題です。6

患者間で結石の種類が異なるため、食事制限や水分摂取、数種類の FDA 承認薬の投与、結石を除去するための外科的処置など、個別の治療管理が必要となります 7。その蔓延は依然として社会経済的に大きな注目を集めていました。したがって、新たな治療法を探すことが必要です8。

結石の予防と治療のための医薬品の探索とともに、結晶化に影響を与える可能性のある修飾剤がますます注目を集めています。9 カルシウム結石の最も効率的な修飾剤は、結晶表面および/または相互作用できるカルボン酸、硫酸塩官能基で構成されています。 10 多くの天然および合成種は、その増殖を阻害する可能性があります。しかし、in vitro と in vivo の証拠を橋渡しすることは依然として非常に困難です。実験研究、動物研究、臨床試験を組み合わせることで、結晶成長の修飾と結晶化におけるその機能についての認識が促進される可能性があります。5 これまでのところ、ポリアクリル酸と二価イノシトールリン酸分子の 2 つの分子だけが、腎臓への CaOx の沈着を減少させることにより、CaOx の結晶化を阻害します。

尿路結石症の病因は、多くの代謝因子および外部因子と関連しています。そのメカニズムはまだ完全には理解されていませんが、尿の成分が影響していることは疑いのない事実です。4 尿は、腎臓結石の発生の阻害剤と促進剤の両方を含む、豊富な分子種の一種の複雑な混合物です。12 腎結石症は、 13 代謝障害は非感染性結石と密接に関連しています。 14 阻害剤の独自の効果を評価することは、約 3,100 個の小分子代謝産物を含む尿の複雑さに対して非常に困難です。半分は特定されていない。尿には約 1,823 種類のタンパク質が含まれており、そのうち 671 種類の成分が最近特定されたものです。15

メタボノミクスは主に細胞や組織内の低分子物質を研究します。これらの物質は体の健康と密接に関係しており、主に生理的または病理学的条件下でさまざまな物質が代謝されることによって得られます。現在、個別化治療の分野では、低分子物質が広く注目され始めており、バイオマーカー研究の基礎となっています 16,17。腎臓研究の分野では、メタボノミクスが広く使用され、顕著な成果を上げています。腎臓病の診断のための新しいマーカーの研究にも使用されています18。バイオ情報技術の急速な発展に伴い、メタボノミクス技術の適用範囲も拡大しています。例えば、疾患メカニズムの研究や標的選択の分野に応用されています。さらに、メタボノミクス手法は、CaOx 結石動物モデル研究分野でも高い応用価値があり、これにより多くの異常な代謝経路が特定されました 19。最近では、メタボロミクス手法は、腎結石の可能性がある腎結石患者の尿の調査にも使用されています。この病気の治療には高い価値がある20。

私たちのこれまでの研究では、結石は膀胱増大後の初期 (1 ～ 2 週間) に必ずウサギの膀胱に形成され、時間の経過とともに消失するか発症する可能性があることが示されています 21。 CaOx 結晶に関する最近の研究で、非常に少ない修飾剤で結石の溶解につながる新しい阻害経路が発見されるまで、この結晶はウサギの尿道の周囲よりもはるかに大きく、自律的に排泄することが困難でした。22 新しい結晶阻害剤を特定するには我々は、治療介入の新たな標的を特定し、in vitro と in vivo での発見の橋渡しをすることを目的として、非標的メタボロミクスを使用して膀胱結石モデルと正常対照の両方からの尿サンプルを分析しました。

我々は、PC-SIS (プロシアニジン架橋小腸粘膜下層) を使用して、ウサギの膀胱結石モデルの膀胱全層欠損を修復しました21。週（図1b）。サイズ、分布、成分を視覚化するために採取された結石。図 1c、d から、結石はベージュ色の表面を備えた不規則な形状でしたが、結果として得られた腹部超音波検査は結石の全体的な外観とよく一致していました。信頼性の高い特性評価を提供し、原子スケールで尿石の組成を強調表示できる FTIR スペクトル (図 1d) によれば、CaOx とヒドロキシアパタイト (HAP) がサンプルの典型的な成分です。 1036 cm-1 の吸収バンドは HAP 伸縮によるものですが、660 cm-1 の吸収バンドは COM 振動に対応している可能性があります。 1643 cm-1 (C = O 振動) および 780 cm-1 (CC 伸縮) の診断バンドはカルシウムの特徴です。発見されたように、シュウ酸カルシウム二水和物（COD）はサンプルに大きく寄与しています。23 生化学的尿分析（図 1e、f）によれば、手術後 2 週間でカルシウムのレベルが大幅に増加しました。対照的に、血中カルシウム濃度は、モデル動物と正常対照動物との間で差がなかった。

石の動的な変化と成分分析。 a、b 2週目および4週目の正常対照および膀胱結石モデルの腹部超音波検査による膀胱の代表的な画像。 c 同じ個人から採取した結石サンプルの全体像と腹部超音波検査。 d 石の赤外線スペクトルと全体的な形態。 e、f 尿および血液サンプル中のカルシウムレベルの定量化。 *対照群と比較して P < 0.05。 (e – f) の場合、各グループのウサギは n = 10 匹です。

注目すべきことに、結石の最大 70% が 4 週間までに消失しました (図 1b)。成ウサギの尿道サイズは、さまざまな尿道圧の下で 4 ～ 10 mm と変化しますが、これは結石のサイズよりもはるかに小さく、自然に排泄されることが困難です (補足表 1)。 24 尿路結石の形成には複数のプロセスがかかります。これには結晶核生成、結晶形成、凝集が含まれており、後者は結晶阻害剤と促進剤によって制御されています25。顕微鏡分析により、溶解は主に腎臓結石の鉱生成過程で起こっているという証拠が示されました26。これは、結石が結石であるという広く信じられている概念に矛盾しています。は溶解できず 27,28 、標的を絞った生体内溶解により結石症の有害な影響を軽減できるという臨床アプローチの新しいパラダイムを切り開きました。一方、このことは、結石の動的変化が尿中の結晶修飾因子の存在に起因する可能性があるかどうかを検討することにもつながりました。代謝産物の複雑な混合物として、尿には、いくつかの活性修飾因子（結晶阻害因子および促進因子）を含む約 3,100 個の小分子が含まれています 29。そのため、病理学的結石の発生に影響を与える可能性のある阻害因子を特定することは困難です。

結晶修飾物質が存在する可能性が高いことは、代謝産物を含む一部の天然の尿組成物が結晶の成長と結石の形成に影響を与える可能性があることを示唆しています。異なる時点（膀胱増大手術後1、2、3、4週間）での正常対照（10サンプル）および膀胱結石モデル（10サンプル）からのサンプル（図2a）。図2bから、主座標分析（PCoA）に基づいて、負の代謝産物は正常対照群と手術治療群の間で明確に分離されました。この目的のために、我々は負の代謝物に焦点を当て、PLS-DA分析によって手術後のさまざまな時点でのコントロールとモデル間の分離を定量化し、2つのプロファイル間の明らかな違いを発見しました（補足図1）。ペアワイズ（補足図1）および複数グループ比較（図2c）による経路分析により、ABCトランスポーター、リジン分解、フェニルアラニン代謝およびチロシン代謝経路がKEGGの大幅な濃縮として特定されました。濃縮された経路に関与する代謝産物をさらに詳しく説明するために、4つの経路のコントロールグループとモデルグループのヒートマップをプロットし（図2dおよび補足図1）、2つのグループ間の代謝物の違いを明らかにしました。

メタボロミクスプロファイリングにより、結晶阻害剤の候補として 5 つの有機分子が特定されました。 a メタボロミクスプロファイリング実験の設計を表す概略図。 b 尿サンプルの代謝産物プロファイルに基づく、対照動物およびモデル動物の正イオンおよび負イオンの主座標分析 (PCoA)。 c 対照群とモデル群の KEGG 経路濃縮分析。 d ABCトランスポーター、リジン分解、フェニルアラニン代謝およびチロシン代謝経路のヒートマップ。 e 代謝産物プロファイルと統計分析に基づく 5 つの有機分子の変化、*対照群と比較して P < 0.05。 (a ～ e) の場合、各グループのウサギは n = 10 匹です。

多プロトン性有機物と結晶は、カルシウム石化系の静電気によって相互作用する可能性があり、有効な阻害剤をスクリーニングするための基準は、複数の荷電基を有する分子である30。実際、カルシウム結晶に対して最も効果的な阻害剤の一部には、カルボン酸塩 (-COOH)、尿中の結晶表面と相互作用できるヒドロキシル (-OH) および/または硫酸 (-OSO3-) 官能基 31,32。したがって、ヒートマップ分析に基づいて、タウリン (-OH)、差次的に発現された代謝産物からのスベリン酸 (-COOH)、コハク酸 (-COOH)、サリチル酸 (-COOH、-OH)、およびゲンチシン酸 (-COOH、-OH) をさらなる分析に使用します (図 2e)。統計分析の結果、有機酸レベルの変化には明らかな規則性は見られず、有機酸が結晶修飾において多様な役割を果たしていることが示唆されました。

密度汎関数理論 (DFT) を使用して、修飾子の作用を解明しました。 COM(100)表面における修飾剤の吸着エネルギーは、ゲンチシン酸＞サリチル尿酸＞コハク酸＞スベリン酸＞タウリンであった。 COM (021) 表面上の修飾剤の結合エネルギーは、サリチルル酸とスベリン酸を除いて、COM (100) 表面の結合エネルギーと一致しました (補足表 2)。他の修飾剤と比較して、ゲンチシン酸とCOM (100) および (021) 表面との結合の強さはより強かった（図 3b、c）。 COM (100) および (021) 表面に結合した修飾子の強度を定量化するために、原子の平均変位 δ を計算しました (補足表 3)。結果は、(100) 表面上のすべての修飾剤の吸着により、(021) 表面と比較してより高いひずみが生じることが明らかになりました。ゲンチジン酸と COM 表面との結合により、最も高いひずみ (100 δ = 0.418 Å; 021 δ = 0.206 Å) が生じます。対照的に、タウリンのひずみは最も低くなります (100 δ = 0.211 Å; 021 δ = 0.099 Å)。一定の引張応力下では、結晶の歪みにより成長速度が低下する可能性があることが以前に実証されています。これは、ゲンチシン酸の結晶成長防止効果がタウリンよりも優れていることも示唆しています。22,33

COM 表面上の修飾剤と Ca2+ の結合エネルギー。 a COM、タウリン、スベリン酸、コハク酸、サリチルル酸、ゲンチシン酸の最適化された構造。 b、c COM (100) および COM (021) 表面上の分子の構造を最適化。ライトピンク、ライトブルー、ブラウン、ブルー、イエロー、レッドのボールは H、Ca、C、N、S を示します。とO原子です。 d Ca2+に吸着されたタウリン、スベリン酸、コハク酸、サリチルル酸、ゲンチジン酸のX線光電子スペクトル（XPS）。青、ピンク、赤のフィッティングされたピークは、それぞれ C = O、C-O、C-C の C1s ピークに対応します。

COM 表面相互作用に加えて、この研究では、修飾剤と Ca2+ の調整も分析しました (補足図 2a、補足表 4)。計算によれば、ゲンチシン酸、サリチルル酸、およびコハク酸塩は、スベリン酸およびタウリンと比較して、Ca2+ イオン複合体に対して高い親和性を示すことが示されました。ゲンチジン酸と Ca2+ の結合は最も活発でした。修飾剤と Ca2+ の相互作用の種類は、XPS 分光法に基づいて検出されました（図 3d、補足図 2b、および表 5）。 XPS 分光法における結合エネルギーは、原子の電荷によって引き起こされる小さな化学シフトによって決まります。したがって、それは正味の原子電荷と関連しています。34 我々は、Ca2+ と相互作用する可能性がある C = O を持つ有機酸カルシウムおよび有機酸 C1s ピークの変化に焦点を当ててきました。有機酸および有機酸カルシウムのC=Oの変化範囲は結合エネルギーの大きさを反映しており、その変化傾向はゲンチシン酸＞サリチルル酸＞コハク酸＞スベリン酸＞タウリンであり、DFT計算と同様の傾向であった。修飾因子の阻害効果の多様性を考慮すると、in vitro および in vivo 実験を通じて修飾因子の阻害効果をさらに実証する必要があります。

修飾剤の有無にかかわらず、バルク結晶化を顕微鏡で検出し、対応する結晶サイズと形態の変化を判定します。この技術により、結晶化解析時に侵入操作を行う必要がなく、より効率的かつ正確にモディファイアの効果を解析することが可能となります。光学顕微鏡写真によると、タウリンとスベリン酸は、対照と比較して、結晶形態および面積に明らかな影響を示さなかった。対照的に、コハク酸、サリチル酸、ゲンチシン酸は古典的な正方晶系の結晶を生成します (図 4a、b)。これは、結晶成長速度の阻害とその根底にあるCOM核生成の抑制を反映しています（図4b、4c）。結晶成長の古典的なメカニズムには、2D 層状核生成と結晶面を横切るステップの進行が含まれていました。結晶表面に阻害剤が存在すると、結晶の形成と成長が妨げられる可能性があります。 35 結晶表面トポロジーの原子間力顕微鏡 (AFM) 検査 (図 4e) では、対照結晶とタウリン結晶の深さの変化が最も小さいことが示されました (3 ミリメートル以内)。 nm)、結晶表面には欠陥がありますが。ゲンチシン酸とコハク酸塩の介入後、明らかな結晶成長が見られます。ゲンチシン酸処理した結晶の表面欠陥は最も大きく、その範囲は約 8 nm でした。コハク酸塩結晶には成長過程で規則的な深い亀裂（深さ5nm）が観察されますが、これは結晶阻害剤によって結晶成長の方向が変化し、さらに結晶構造の安定性が低下したためと考えられます。

インビトロでのCOM核形成の阻害。 a 光学顕微鏡写真 (スケールバー: 20 μm) および SEM (スケールバー: 2 μm および 4 μm) の顕微鏡写真。 b – d 結晶化領域、COMおよびCODの数と比率の半定量分析（COM-CaOx一水和物、COD-CaOx二水和物、nd-未定義）、*対照群と比較してP <0.05。 e 修飾剤の有無にかかわらず、(001) 表面の成長と阻害の AFM 画像 (スケールバー: 400 nm)。 f 修飾子ありまたはなしの FTIR スペクトル

これまでの研究は主にCOM結晶化に対する阻害剤の影響に注目しており、我々の分析は主にCOMとCODの誘導に集中していた。後者を評価するために、COM の比率を測定しました。図4dに示すように、タウリンとスベリン酸は両方とも、正常対照（36％±8％）と比較してCOM核形成を有意に促進しました（それぞれ52％±5％および49％±15％）。コハク酸、サリチル酸、ゲンチシン酸はいずれも、正常対照（13% ± 2%）と比較して、COM 核形成が 30% 未満、COD 核形成が 37% を超えており、COM 核形成に対する阻害効果が確認されました。 FTIR実験（図4f）はまた、バルク結晶化システムにおけるコハク酸、サリチル酸、ゲンチシン酸による大部分COM結晶化から大部分COD結晶化への移行を明らかにしました。指紋領域の 660 cm-1 の吸収ピークは、結晶相の大部分が COM であることを示しました。また、914および780cm-1はCODの吸収ピークであった。タウリン基のFTIRスペクトルは類似しており、660cm-1の特徴的な吸収ピークは、CaOx結晶の結晶相の大部分がCOMであることを示していた。サリチルル酸、スベリン酸、ゲンチシン酸およびコハク酸塩を添加した後、結晶溶液の吸収ピークは 1617 および 1322 cm-1 から 1643 および 1330 cm-1 にシフトしました。これは、修飾剤の添加が COD の増加につながったことを示しています。 CaOx 結晶には、COM と COD という 2 つの一般的な形態があります。 COD は不安定性との結合が少ない一方、COM は腎上皮細胞により容易に付着し、凝集して結石を形成する可能性があります 37。したがって、結石形成を抑制する方法は、CaOx の結晶化を標的とし、また、結石の生成を誘導できる修飾剤をスクリーニングすることである可能性があります。 CODの形成。対照と比較して、コハク酸、サリチル尿酸、ゲンチジン酸の添加による COD 結晶の不安定性の増加は、腎臓結石の治療に潜在的な役割を果たしている可能性を示唆しています。

我々は、多プロトン性有機物がEG誘導性の結晶形成に影響を与えるかどうかを評価するために、in vitro結晶阻害を持つ修飾剤（サリチルル酸、ゲンチシン酸、コハク酸塩）を選択しました。結石介入薬ウライトの主成分であるクエン酸が介入群として適用されました。 Sprague-Dawley ラットを阻害剤 (200 mg/kg) または 0.9% NaCl で毎日強制経口投与して処理しました。その間、実験群およびモデル群のラットには、結晶形成を誘導するために1% EG溶液を受け入れた。４週間後、ラットの腎臓の全体的な外観（図５ａ）および重量（図５ｃ）、ならびに体重（図５ｂ）を分析して、ラットの基本状態を評価した。クエン酸とコハク酸はどちらもEG誘発ラットモデルに対して保護効果を示し、コハク酸介入群は腎臓の外観、体重、体重が正常対照と同様であったのに対し、サリチルル酸とゲンチシン酸は腎臓保護に有意な効果を示さなかった。。 NaCl、サリチルル酸、ゲンチジン酸で処理したEG誘発ラットモデルは4週間以内に結石を発症しましたが、クエン酸とコハク酸で処理したラットモデルは、血中BUNと血漿クレアチニンのレベルが低下するとともに、結石形成の有意な阻害を示しました（図5d–h）。）。

コハク酸塩は、EG 処理ラット CaOx 結晶化モデルにおいて腎臓の結晶沈着と損傷を軽減しました。腎臓の全体的な外観。 b、c 体重および腎臓の重量、*対照群と比較して P < 0.05; # モデルグループと比較して P < 0.05。 d マイクロCTイメージング、e、f ラット腎臓の切片をVon Kossa染色（スケールバー：400μm）によって結晶沈着について染色し、結晶の暗い領域を定量化しました（モデルグループと比較して# P < 0.05）。 g、h 血漿血中尿素窒素 (BUN) およびクレアチニン (CREA)、*対照群と比較して P < 0.05。 # モデルグループと比較して P < 0.05

我々はさらに、さまざまなグループのラットの腎機能に対する修飾因子の影響を評価しました。フォン・コッサ染色（図５ｅ、ｆ、補足図３）によれば、ＥＧ処置ラットの皮質と髄質との間の境界領域には豊富な結晶が存在した。クエン酸、サリチルル酸およびゲンチシン酸と比較して、EG処理後のコハク酸基ではCaOx結晶沈着が明らかに低かった(P<0.05)。腎臓損傷は過ヨウ素酸シフ（PAS）染色によって検出され、尿細管損傷についてスコア付けされました（補足図4a、4b）。予想通り、4週間のコハク酸塩強化食により、EGで治療したラットと比較して腎損傷が大幅に軽減されました。注目すべきことに、腎臓損傷のレベルは、クエン酸群と比較してコハク酸塩処理によってさらに減少し、腎臓組織からのシュウ酸のより多くの流出を示唆し、これは腎臓への損傷が軽度であることと一致していた。免疫組織化学（IHC）により、CD44、IL-6、およびOPNの強度（補足図5）は、対照グループよりもEG治療グループの尿細管で上方制御されました。コハク酸塩の投与により、CD44、IL-6 の発現が有意に阻害され、これは組織学的および機能分析の結果と一致しました。

結晶形成中のラットモデルトランスクリプトーム再プログラミングに対するコハク酸塩の全体的な影響は、EG 処理の 4 週間後に収集された腎臓組織の RNA-seq に基づいて測定されました。経路分析と Q-PCR の結果は、コハク酸グループの差次的に発現された遺伝子 (DEG) はアミノ酸代謝について大幅に富んでいるのに対し (図 6a、c、補足図 7)、コハク酸グループのものはアミノ酸代謝について大幅に富んでいることを示唆しました。腎損傷に対して保護効果を発揮したEG処理モデルと比較した免疫応答および細胞間接着分子（図6b、c、補足図7）。 RNA-seq分析によると、EG処理グループは、コントロールと比較して、モデル腎臓における炎症誘発性分子、接着分子、破骨細胞分化細胞などを含む経路の同様の濃縮を示しました（補足図6a）が、方向は逆でした。アミノ酸代謝経路の観点から（補足図6b）。

RNA配列決定によって示される、コハク酸塩によるEG誘発性腎臓損傷の回復。 a、b RNA-seq データセットに基づく、コハク酸塩および EG 処理によって影響を受ける生物学的プロセスの遺伝子オントロジー (GO) 用語濃縮分析。 EG治療モデル群と比較した、コハク酸治療群における上方制御されたプロセス（左）および下方制御されたプロセス（右）。 c コハク酸処理およびEG処理モデルグループと対応するコントロールのRNA-seqデータセットのペアワイズGSEA経路比較を示すドットプロット。青と赤の点は、それぞれ下方制御された経路と上方制御された経路を表しました。 d RNA-seqデータセットに基づく、EG処理モデルグループとコハク酸グループ間のDEGの発現倍率変化を示す散布図。 e RNA-seq分析に基づいた、EG処理群およびコハク酸処理群のラット腎臓組織における炎症、アポトーシス、および生存事象に関連する遺伝子の発現を示すヒートマップ。 (a – e) の場合、各グループのラット n = 3 匹

さらに、EG治療後の炎症反応、接着分子、破骨細胞分化などの腎損傷に対するコハク酸塩の改善機能は、大幅に逆転した。これは、モデルグループの遺伝子レベルの変化がコハク酸によって大幅に逆転したトランスクリプトーム関連のヒートマップ解析によって検証されました。示されているように、アミノ酸代謝に関与する遺伝子は主にコハク酸基に豊富に含まれていました。対照的に、EG処理モデルは、細胞損傷に関連する遺伝子の濃縮とともに、腎損傷（すなわち、遺伝子誘導）との強い相関関係を示した（図6d、e）。散布図とヒートマップ分析は、DEG の中で、対照群の DEG は明らかに細胞アミノ酸代謝が豊富であるのに対し、モデル群の腎臓で下方制御されている DEG は EG 治療群と比較して接着分子と破骨細胞の分化が明らかに豊富であることを示唆しました。（補足図6d、e）。

尿路結石の発生における主な出来事には、結晶核形成、結晶成長、および結晶細胞接着が含まれます。 38 結晶表面の相互作用部位を標的とすることにより、結晶化阻害剤は結晶成長速度を低下させるための代替アプローチを提供する可能性があります。しかし、これまでのところ、尿路結石症の治療に使用できる CaOx 結晶化の治療法はありません。 22,39 この研究では、結石（膀胱）からの理論に基づいたメタボロミクスを通じて、5 つの潜在的な結石介入修飾因子を特定しました。結石）から結石（腎臓結石）へ。これらのうち、コハク酸、サリチル尿酸、およびゲンチシン酸は、インビトロで結晶阻害効果を示した。注目すべきことに、EG誘発性ラット腎臓結石を治療するための対照としてクエン酸を使用した場合、コハク酸は保護効果に加えて、腎カルシウム沈着の優れた阻害を示しました。さらに、トランスクリプトーム分析により、コハク酸塩の保護効果は主に抗炎症、細胞接着と骨形成の阻害、およびアミノ酸代謝の調節によるものであることが示されました。

最近、小分子やペプチドからタンパク質に至るまで、結晶成長のさまざまな修飾剤、最も一般的には阻害剤が開発されています。カルボキシレート、リン酸官能基を持つ分子は、COM の結晶成長に対して顕著な防止機能を発揮します。38,40 この基準と厳格なスクリーニングに基づいて、非ターゲットのメタボロミクスデータを詳細に分析したところ、タウリン、スベリン酸、コハク酸、サリチルル酸が硫酸基やカルボン酸基を持つ酸やゲンチシン酸は結晶表面と相互作用して、結晶の成長に影響を与える可能性があります。 CaOx 結晶化阻害剤の in vitro 有効性を比較することは、試験方法とパラメーターの違いにより困難です。本研究では、DFT理論計算とCOMバルク結晶化試験を組み合わせて、各修飾剤の抑制効果を総合的に評価しました。結晶表面の汚れが阻害剤の吸着によって生じるというメカニズムに基づいています。41,42 COM (100) および (021) 表面に結合する修飾剤の歪みは、ゲンチシン酸、サリチル尿酸、およびコハク酸塩が最も高い平均変位 (Å 単位) を示すことを示しました。 ) 結晶相互作用がタウリンやスベリン酸よりも活発であることを示しています。さらに、各分子の Ca2+ への結合能力を計算しました。これは、XPS 結果の傾向と一致していました。小分子の Ca2+ への結合力の強さは、主に C = O の酸素の電気陰性度に依存しました。電気陰性度が強いほど、Ca2+ への結合エネルギーも強くなります。結晶化アッセイの結果は、コハク酸、サリチル尿酸、ゲンチシン酸が結晶のサイズと数を減少させる可能性があることを示しており、これは COM 結晶化阻害剤に関する以前の研究と一致しています。43,44 結晶化中に、コハク酸、サリチル尿酸、ゲンチシン酸はCOD は上皮細胞膜分子に対する親和性が低いため、COM を COD 結晶化にシフトさせ、治療効果をもたらす可能性があり、それによって尿細管内滞留が減少する可能性があります。11,45,46

インビボでの腎臓結石に対する結晶阻害剤の効果を調べるために、我々は、EG を使用して尿細管におけるシュウ酸塩の過剰な沈着を誘発する EG 誘発ラットモデルを構築しました。尿細管に沈殿したシュウ酸塩は、CaOx 腎結石形成の主な危険因子です 47。結晶阻害剤とクエン酸塩をラットモデルに適用して、腎臓結石に対するそれらの影響を評価しました。これらの中で、クエン酸塩は、Ca2+ イオンと結合することで腎臓結石の生成を阻害するよく知られた阻害剤の一種であり、シュウ酸塩と結合する遊離カルシウムを減少させます。 48,49 EG 誘発ラットにおける腎臓の形態変化は、コハク酸塩の適用により改善されました。われわれは、コハク酸塩がEG誘発性のCaOx沈着を劇的に逆転させ、尿細管細胞損傷とアポトーシスを減少させることを発見した。コハク酸塩の細胞保護効果は、血清クレアチニンレベルの低下によって in vivo でさらに確認されました。腎臓の CaOx 沈着と損傷に対するコハク酸塩の保護機構を RNAseq によってさらに調査しました。炎症、細胞接着および骨形成の顕著な上方制御は、腎臓のEG誘発によって引き起こされた。抗炎症作用と骨形成作用のあるコハク酸塩は、アミノ酸代謝関連遺伝子の上方制御だけでなく、遺伝子レベルの変化もほぼ完全に阻止します。コハク酸は、IL-1、IL-6、OPN などの骨形成関連遺伝子の発現レベルを下方制御します。これらの遺伝子は、生体内での腎損傷および CaOx 沈着と非常に密接に関連しています。50,51 発現の下方制御により、CaOx 結晶の付着が減少します。 CD68 と CD44 のレベルは、腎臓における CaOx の沈着を阻害する新しい経路を提供する可能性があります。52 この結果は、腎臓結石とその調節に対するコハク酸塩の保護効果のさらなる研究を保証するものです。53

この研究では、優れた有効性を持つ新しい結晶抑制剤コハク酸塩を同定し、CaOx 沈着に対するその生体内効果を示しました。コハク酸は、腎臓結石を予防する効果的な治療法として期待されています。これまでのところ、腎臓の CaOx 沈着と損傷に対する抑制効果を検証することを目的とした、パイロットラット腎臓結石モデル研究のみが実施されました。しかし、他の泌尿器官、特に膀胱に対するコハク酸の影響はまだ検証されていません。同時に、コハク酸塩の投与が他の動物モデルにおいて腎臓結石の進行を抑制し、末梢血および尿のメタボロミクスを変化させることができるかどうかを確認することは興味深い（そして重要）であろう。フォローアップ研究では、この分野でコハク酸塩の前向き臨床試験を行う前に、ヒトにおけるコハク酸塩の代謝経路、最適な投与計画、忍容性をより深く理解する必要がある。私たちはまた、コハク酸塩の下流標的にも非常に興味を持っています。これは探索する価値があり、その臨床応用を進める道を提供する可能性があります。

塩化カルシウム（CaCl2、97%）、シュウ酸ナトリウム（Na2C2O4、99.5%）、クエン酸（C6H8O7、99%）、COM（CaC2O4・H2O）、サリチルル酸（C7H6O3、99%）、コハク酸塩（C4H6O4、99%）、ゲンチシン酸 (C9H9NO5、98%)、タウリン (C2H7NO3S、99%)、スベリン酸 (C8H12O4、99%)、塩化ナトリウム (NaCl、AR) および EG (C2H6O2、99.8%) は Sigma Aldrich から購入しました。

すべての実験は四川大学の倫理委員会によって承認されました (記録番号 2018190 A)。 20 匹の雄ニュージーランド白ウサギ (各 2.5 ± 0.5 kg) をランダムに正常対照群と膀胱結石モデルグループに分けました。 2週間の隔離期間の後、実験動物は手術前に12時間絶食させられた。その後、ペントバルビタールナトリウム (2 mL/kg) の注射により麻酔をかけました。下腹部に適切なサイズの切開を行い、膀胱を露出させた。次に、部分的に全層の膀胱壁を除去し、必要な後壁欠損モデルを確立しました。滅菌後、1 mg/mL PC-SIS を可溶性縫合糸 (5-0、ジョンソン、米国) 22 で完全に縫合し、明らかな差異のない 4 本の縫合線 (5-0 モノクリル) を得て、背中の欠陥をマークしました。壁を構築し、その後の分析をサポートします。筋肉と皮膚を縫合しました。手術後、すべての実験動物をケージに戻し、自由に餌を与えた。ペニシリンを 3 日間連続して筋肉内注射しました。異なる時点 (1、2、3、および 4 週間) で、非標的メタボロミクス分析のためにウサギの代謝ケージによってウサギの尿を採取しました。尿サンプルを 1.5 mL EP チューブに収集し、4 °C で 30 分間高速条件で遠心分離しました。サンプルは -80 °C 環境で保管されました。さらに、尿および血中カルシウム分析のために尿および血液サンプルが収集されました。

膀胱結石は2週目と4週目に超音波で検出されました。そして、最大の膨張が達成されるまで、温かい滅菌生理食塩水を膀胱に注入しました。超音波検査は、超音波システム（Philips、Best、オランダ）を使用して実施されました。サンプルは収集、粉砕され、KBr ペレット圧縮法に基づいた波長範囲 500 ～ 4000 cm-1 の強化された石分析システム (Lanmode LIR-20) で検出されました。

非ターゲットメタボローム分析では、ウサギ尿サンプルの 1 ml アリコートを 1 ml のアセトニトリル/メタノール/水溶液 (2:2:1、v/v) と混合し、ボルテックス混合し、30 分間超音波処理し、-20 で放置しました。 °Cで1時間遠心し、その後4°Cで30分間高速遠心分離しました。次に真空下で乾燥させた。質量分析のために、乾燥サンプルに 100 μL のアセトニトリル (1:1、v/v) を加えて分離し、15,000 × g で 20 分間、4 °C で遠心分離しました。

非ターゲットメタボロミクスは、超高性能液体クロマトグラフィーシステム (UHPLC; Infinity LC; 米国カリフォルニア州) と一致する質量分析計 (TOF 6600; AB Sciex, Concord, Canada) を使用して得られました。尿代謝産物は、4 °C、用量 2 μL の最適化された条件下で分離されました。流量は 0.3 mL/min、クロマトグラフィー分離プログラム：0 ～ 1 分、85% B。 1 ～ 12 分、85 ～ 65% B; 12 ～ 12.1 分、65 ～ 40% B; 12.1 ～ 15 分、40% B; 15 ～ 15.1 分、40 ～ 85% B。 15.1 ～ 20 分、8% B (A、25 mM 酢酸アンモニウムおよび水酸化アンモニウム水溶液、B、アセトニトリル)。 UHPLC-MS 分析中の制御温度は 4 °C です。質量分析中に、ESI ソースが選択され、ソース温度 600 °C でさまざまな検出モードが実行されました。

元のデータが決定された後、ProteoWizard ツールを使用してそれを変換し、内のデータを取得します。 mzML形式。次に、XCMS を使用してピークの位置合わせと補正操作を実行し、ピーク領域に関する情報を抽出します。 XCMS 抽出の場合、欠損値が 50% を超えると判断された場合は、対応するイオンピークを削除します。パターン認識ではSIMCA-P 14.1ソフトウェアを適用し、パレートスケーリング法によるデータの前処理を行った後、主にPCA解析やPLS-DA解析などの統計解析を行います。 PLS-DA メソッドは、主に R2 と Q2 の品質、および変数重要度 (VIP) を決定するために使用されます。 VIP は主に、特定の代謝産物によって説明される病理学的刺激反応の変化を記述します。有意差のある代謝物を判定する場合、設定した判定基準はVIP＞1、P＜0.05とした。差次的に発現された代謝産物を正規化して、同様の発現パターンを持つクラスターを取得しました。ヒートマップは、R ソフトウェアに基づいて差次的に発現された代謝産物をクラスタリングすることによって導出されました。 KEGG 分析は超幾何検定で実行され、P < 0.05 の経路が有意であるとみなされました。

CaCl2 および Na2C2O4 をそれぞれ脱イオン水に溶解して、10 mM のストック溶液を形成しました。 10 mL 反応システムのバルク結晶化は、きれいなガラスバイアル中で実行されました。まず、150 mM NaCl 水溶液をバイアルに添加し、次に均一に混合しながら 0.7 mL CaCl2 溶液を添加しました。続いて、ガラスバイアルを 60 °C で 1 時間インキュベーターに置き、その後 0.7 mL の Na2C2O4 原液を滴下しました。結晶抑制剤、例えば、タウリン、スベリン酸、コハク酸、サリチルル酸およびゲンチシン酸を、Ｎａ２Ｃ２Ｏ４添加前に反応系に適量で添加し、最終溶液は１．５ｍＭの結晶抑制剤を含む。結晶を収集するために、きれいなスライドガラスをバイアルの底に置きました。 60℃で3日間インキュベートした後、スライドを取り出し、その後の特性評価のために洗浄および25℃で乾燥させた。

結晶の形態と密度は、最初に光学顕微鏡 (Ti2-U、ニコン、日本) で分析されました。少なくとも 5 つのフィールドの結晶の面積と数は、Image J ソフトウェアを使用して推定されました。さらに、ＣＯＭとシュウ酸カルシウム二水和物（ＣＯＤ）との比を、すべての結晶を計数することによって分析した。金スパッタリング処理後、スライドガラス上の結晶の形態をSEM (EVO、ZEISS、ドイツ) によってさらに検査しました。特に、COM と COD という 2 つの異なるタイプのシュウ酸カルシウムを観察し、写真を撮りました。 CaOx 結晶化に対するさまざまな結晶抑制剤の影響をさらに評価するために、原子間力顕微鏡 (AFM、Asylum Research、米国) を実行して、結晶 (001) 表面のトポグラフィー画像、特にエッチング現象を調べました。画像は、タッピングモード (スキャン範囲: 2 μm、スキャン速度: 0.5 Hz) でバネ定数 60 N/m のチップを使用して収集されました。

結晶の構造は、XPS (Kratos、英国) およびフーリエ変換赤外分光法 (FTIR、INVENIO R、スイス) で検証されました。さまざまな COM 結晶の FTIR スペクトルが 1000 ～ 4000 cm-1 の波長範囲で測定されました。 XPS に関しては、CasaXPS ソフトウェアを使用して、さまざまな COM 結晶、タウリン、スベリン酸、コハク酸、サリチルル酸、およびゲンチシン酸の C 1s、N 1s、および O 1s スペクトルをフィッティングしました。

密度汎関数理論 (DFT) を使用して、さまざまな結晶抑制剤と CaC2O4 表面の間の相互作用を理論的に調査しました 42。一般化勾配近似 (GGA) 汎関数が適用されました。モンクホルストパック法はブリルアンゾーンサンプリングプロセスに適用されました。エネルギーの収束標準は 10−5 eV/原子でした。

コハク酸、タウリン、サリチルル酸、スベリン酸、ゲンチシン酸などの結晶抑制剤分子の CaC2O4 表面上の結合エネルギーを計算しました。 CaC2O4 (100) および (021) 表面は、それぞれ 2 × 2 および 2 × 1 スーパーセルによって構築されました。相互作用を防ぐために15Åの真空空間が適用されました。 DFT-D2 法を適用して、結晶抑制剤分子と CaC2O4 表面の間の vdW 相互作用を計算しました。一方、結合エネルギー (Eb) の式は次のとおりです。

ここで \(E_{\left( {\rm{分子}} - {\rm{CaC}}_{2}{\rm{O}}_4\right)}\)、および \(E_{{\rm {CaC}}_2{\rm{O}}_4}\) は、それぞれ分子が吸着した CaC2O4 表面、清浄な CaC2O4 表面の DFT エネルギーを指します。

この研究では、以前の研究で参照したように、吸着質 (成長阻害剤) の存在の有無にかかわらず、CaC2O4 表面の凍結構造と緩和構造を幾何学的に比較しました。距離測定法を使用して、CaC2O4 結晶の表面上の緩和原子の変位を定量化しました。平均変位δは次の式で計算できます。

ここで、Natoms は CaC2O4 平面上で緩和された原子数を指します。

さらに、Ｃａ２＋と結晶抑制剤分子（すなわち、タウリン、スベリン酸、コハク酸、サリチルル酸、ゲンチシン酸）の間の平均変位および結合エネルギーを同様の方法で導出した。

Chengdu Dossy Animals Factory から購入した雄の SD ラットをブランク対照群、腎臓結石モデル群、治療群 (クエン酸、タウリン、スベリン酸、コハク酸、サリチルル酸、ゲンチジン酸) に分類し、各群に少なくともネズミが5匹。 SD ラットで腎臓結石モデルを構築するためにエチレングリコールが使用されました。54 具体的には、モデルは 1% v/v EG を含む飲料水を 28 日間継続的に与えることによって構築されましたが、対照群には飲料水のみが与えられました。モデリング中に、クエン酸、タウリン、スベリン酸、コハク酸、サリチルル酸、ゲンチシン酸でそれぞれ処理を実行しました。ラット腎臓結石モデルに使用した阻害用量（200 mg/kg）は、クエン酸（uralyt-U の有効成分）の臨床治療濃度を体表面積に基づいてラットに換算し、それに基づいて計算されました。続いて、ラットをタウリン、スベリン酸、コハク酸、サリチルル酸、およびゲンチシン酸の水溶液で２８日間毎日強制経口投与した。すべてのラットは実験中ずっと生きていました。各ラットの初期体重を記録し、毎日の体重に応じて強制経口投与量を調整した。

ラットに麻酔をかけ、心臓を完全に露出させた状態で仰臥位に固定した。使い捨て真空採血管を用いて右心室から3mLの血液を採取し、腎臓を採取した。サンプルを 25 °C で 15 分間放置し、15 分間遠心分離しました。生化学的アッセイのために 1 mL の上清を吸引しました。腎臓の形態を写真で記録した。そして、それぞれの腎臓の重さを量り、記録した。次に腎臓を 4% パラホルムアルデヒド固定液に保存するか、その後の分析のために凍結しました。

腎臓サンプルはパラフィン包埋のために 10% ホルマリン溶液で固定され、染色のために 10 μm の厚さに切片化されました。結晶形成はフォン・コッサ染色に基づいて検出された。結晶堆積物を光学顕微鏡写真およびImage Jソフトウェアによって分析した。腎臓切片にPAS染色を施し、尿細管損傷はPaIIer法により採点した：尿細管拡張および平坦上皮細胞（1点）、尿細管円柱（2点）、破片のない尿細管内腔内の壊死細胞および剥離細胞（1点） ); 上皮細胞濃縮 (1 ポイント).55

免疫組織化学 (IHC) の場合、腎臓切片をキシロール、勾配エタノール中でインキュベートし、その後、内因性ペルオキシダーゼの活性をブロックするために 3% H2O2 中でインキュベートしました。 CD44 (ab189524、Abcam)、IL-6 (ab9324、Abcam)、および OPN (ab11503、Abcam) 抗体を 4 °C で一晩インキュベートしました。切片を PBS ですすぎ、HRP 結合二次抗体 1:200 希釈で 37 °C で 1 時間インキュベートし、結合 HRP の検出のために DAB に曝露しました。そして、画像はImage Jツールで評価されました。

術後 4 週間目に、対照群、モデル化群、コハク酸群からラットの腎臓を採取しました (n = 3)。 total RNA の抽出プロセスでは、RNeasy キット (Qiagen、ドイツ) を使用して、得られた RNA を超低温で保存しました。対応する説明書に従って、TruSeq は対応する RNA キット (Illumina、USA) を通じて合成されました。この合成実験では、まず、ポリAを含むmRNAを磁気ビーズにより精製した。次に、対応するキットのスキームに基づいて、mRNA をランダムに断片化して二本鎖 cDNA を取得しました。その後、その後の手術をサポートするために端部修復とdAテール処理を行いました。産物を精製し、PCR によって濃縮して、必要な cDNA ライブラリーを取得しました。 Qubit は精製ライブラリーの定量分析に適用されます。® 2.0 Fluorometer (Life Tech, USA) と 2100 アナライザー (Agilent, USA) を使用してライブラリーをチェックし、モル濃度を計算して分析します。精製したライブラリを希釈した後、cBot によってクラスターが生成され、テストされました。 NovaSeq 6000 (Illumina、USA) を配列決定プロセスに使用しました。

Hisat2 を使用して、ペアの末端配列ファイル (fastq) を Ensembl 参照ゲノムにマッピングし、出力 SAM ファイルを変換して BAM ファイルを取得します。並べ替え中に、SAMtools 1.3.1 が適用されて、マッピングされた読み取り値が BAM ファイルに変換され、その後の FPKM 分析がサポートされます。遺伝子はStringTie1.33bツールによって分析されました。 RパッケージedgeRに基づいてmRNAの差次的発現解析（DEG）を実施し、倍率変化が1.5を超え、P<0.05の遺伝子をDEGとした。火山プロットはソフトウェアパッケージ EnhancedVolcano を使用して描画されました。 FPKM の標準化された遺伝子発現は、R パッケージのクラスタリングツールで処理することによって得られ、これに基づいて同様の発現を持つ遺伝子クラスターが決定されました。ヒートマップでは、遺伝子発現データは式 y = (x-α)/λ によって正規化されます。ここで、x は実際の式を指し、λ はサンプルの分散に対応します。 Metascape オンラインツールは GO エンリッチメント分析に使用されます。 DEG のデータセットを RNA seq によって解析し、その分布を決定しました。 P が <0.05 の場合、経路は有意であると見なされます。

全RNAをTRzol試薬により腎臓サンプルから単離し、PrimeScript™キット(Takara、日本)に基づく逆転写によりcDNAを調製した。 Q-PCR を Lightcycler 96 システム (Roche、スイス) で実行し、mRNA レベルで遺伝子発現を検出しました。プライマーは付録の補足表 6 を参照してください。熱サイクルプログラム: 95 °C で 30 秒。 95 °C で 10 秒、60 °C で 30 秒を 40 サイクル。 Q-PCR による遺伝子発現の相対レベルは 2-ΔΔCt 法で計算されました。

すべてのデータは平均±SDとして表されました。統計的差異は、SPSS 11.0 を使用した独立した t 検定または Tukey の検定による一元配置分散分析で確認されました。有意な閾値は 0.05 に設定されました。

この研究のすべてのデータは、論文および/または補足情報内に提示されています。 RNA-seq 生データはアクセスコード PRJNA874063 で SRA データベースに保管され、元の非ターゲットメタボロームデータはアクセッション番号 MTBLS5921 で MetaboLights に保管されています。

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この研究は、中国国立自然科学財団（助成金番号 32171351）、四川大学西中国病院「1.3.5」専門分野優秀プロジェクト（助成金番号 ZYJC18002）、Med-X Innovation の共同後援により行われました。四川大学 Med-X 材料センターのプログラム (助成金番号 MCM202104)、中国ポスドク科学財団 (2022M722277) および四川大学ポスドク学際イノベーション基金の資金提供によるプロジェクト。四川大学、中国西部の中核施設である組織学および画像化プラットフォームのLei Wu氏とBo Su氏、四川大学分析・検査センターのYun-fei Tian氏とShu-guang Yan氏、そしてMsに感謝します。四川大学西中国病院呼吸器衛生研究所の Nian-guo Zhu が技術サポートを担当しました。動物実験へのご協力をいただいた中国西部病院動物実験センターのXi-jing Yang氏とXiao-ting Chen氏に感謝いたします。

幹細胞・組織工学研究室、整形外科研究所、整形外科、国家主要バイオセラピー研究所、西中国病院、四川大学、成都、四川省、610041、中国

Xiu-zhen Zhang、Xiong-xin Lei、Yan-lin Jiang、Long-mei Zhao、Chenyu Zou、Ya-xing Li、Rui Wang、Qianjin Li、Qiu-zhu Chen、Minghui Fan、Yu-ティン・ソング、ウェンチアン・チャン、ジェシー・リーリン、Hui-qi Xie

四川大学西中国病院泌尿器科、成都、四川省、610041、中国

バイ・ユンジン

610041 中国四川省成都、四川大学西中国病院研究中核施設

イー・チャン

610041 中国四川省成都西中国第二大学病院医療遺伝学科

ジェシー・リーリン

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XZZ、HQX、JLL がアイデアを出し、原稿を作成しました。 XZZ、XXL、CYZ はラット腎臓結石モデルと分析を構築しました。 XZZ、YLJ、YJB はウサギ膀胱結石モデルと解析を構築しました。 XZZ、LMZ、CYZ、RW、QJL、QZC は COM 結晶化と解析を実行しました。 XZZ、XXL、CYZ、LMZ、RW、および QJL が主な執筆者であり、すべての執筆者からの寄稿がありました。著者全員が最終原稿を承認しました。 XZZ、LMZ、および XXL は、非ターゲットのメタボロミクス処理と RNA-seq データを実行しました。

Hui-qi Xie への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

チャン、Xz.、レイ、Xx.、ジャン、Yl. 他。尿路結石症におけるメタボロミクスの応用: コハク酸塩の発見と使用。 Sig Transduct Target Ther 8、41 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41392-023-01311-z

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受信日: 2022 年 9 月 9 日

改訂日: 2023 年 1 月 4 日

受理日: 2023 年 1 月 10 日

公開日: 2023 年 1 月 21 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-023-01311-z

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