強化レア

Nature volume 618、pages 87–93 (2023)この記事を引用

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メトリクスの詳細

技術的に重要な希土類元素は、イオン半径と配位数が微妙に異なるため、分離が難しいことで知られています1、2、3。 天然のランタニド結合タンパク質ランモジュリン (LanM)4,5 は、従来の溶媒抽出ベースの分離に代わる持続可能な代替手段です 6。 今回我々は、希土類イオン半径に敏感なオリゴマー状態をもつHansschlegelia quercus由来の新しいLanM（Hans-LanM）を特徴付け、ランタン(III)誘導二量体はジスプロシウム(III)誘導二量体よりも100倍以上緊密である。二量体。 X線結晶構造は、ランタン(III)とジスプロシウム(III)の間のピコメートルスケールの半径の違いが、第2球の水素結合ネットワークを再配置するカルボン酸シフトを介してハンス・ランMの四次構造にどのように伝播するかを示している。 Meticorbrum extorquens の原型となる LanM との比較により、明確な金属配位戦略が明らかになり、希土類元素内での Hans-LanM のより高い選択性が合理化されます。 最後に、Hans-LanM 二量体界面における重要な残基の構造誘導変異誘発により、溶液中での二量体化が調節され、ネオジム(III)/ジスプロシウム(III) 混合物を単一段階のカラムベースで >98% の個々の元素純度で分離することが可能になります。 。 この研究は、選択的ランタニド認識モチーフの自然な多様性を示し、生体分子ベースの分離プロセスのパフォーマンスを調整するための生物学的原理として、希土類に敏感な二量体化を明らかにしました。

永久磁石から発光ダイオードや蛍光体に至るまで、遍在する現代技術における希土類 (RE) 元素のかけがえのない役割により、分離科学の大きな課題の 1 つであるランタニドの効率的な分離に対する関心が改めて高まっています1。 これら 15 種類の元素の分離は、主な +III イオンの同様の物理化学的性質によって複雑になり、イオン半径は LaIII と LuIII の間で 0.19 Å しか減少しません (参考文献 7)。これにより、これらの金属が再生可能エネルギーを含む金属で共発生することにもつながります。ミネラル。 RE 製造のための従来の湿式冶金による液液抽出法では、灯油や有毒なホスホン酸塩抽出剤などの有機溶媒が使用され、高純度の個々の RE 酸化物を得るには数十、さらには数百の段階が必要です3,8。 再生可能エネルギー分離の非効率性と環境への大きな影響9により、隣接する再生可能エネルギー間の分離係数が大きい代替リガンド10、11、12、13、14、およびより少ない段階で再生可能エネルギーの分離15を達成し、全水性化学反応6を使用するより環境に優しいプロセス設計の研究努力が刺激されています。 16、17、18、19、20。

ランタニド結合タンパク質の LanM ファミリーの創設メンバーの発見は、自然界が合成 f 要素キレート剤の選択性を超える高分子を進化させてきたことを実証しました 4。 M. extorquens AM1 (Mex-LanM) 由来の LanM の原型は、ピコモル濃度のランタニド 4,18 およびアクチニド 21,22,23,24 に対して選択的立体構造応答を受ける小さな (12 kDa) 単量体タンパク質です。メチロトローフ 25 におけるランタニドの取り込みについての理解が深まり、f 元素の検出 26、回収 18,27 および分離 6 のための技術プラットフォームとして機能してきました。 RE キレーターの中では珍しく、Mex-LanM は重 RE (HRE) よりも大きくて豊富な軽 RE (LRE)、特に LaIII ～ SmIII を好みます 4。 Mex-LanM の金属結合モチーフへの 1 つの置換でもアクチニド/ランタニド分離を改善できるという最近の実証 23 により、Mex-LanM のオルソログが異なる、潜在的に有用な金属選択性の傾向を持っているかどうかを調査するようになりました。

本明細書では、英国オークの芽から単離されたメチロトローフ細菌であるHansschlegelia quercus（Hans-LanM）由来のLanMが、Mex-LanMと比較して増強されたRE分離能力を示すことを報告する28。 Mex-LanM は常に単量体であるのに対し、Hans-LanM は単量体/二量体平衡状態で存在し、その位置は特定の RE 結合に依存します。 LanM の 3 つの X 線結晶構造と構造誘導変異誘発により、Hans-LanM の RE 依存性オリゴマー状態と、Mex-LanM よりも優れた分離能力が説明されます。 最後に、これらの発見を活用して、重要なネオジム/ジスプロシウム ペアの Hans-LanM ベースの一段階分離を達成します。 これらの結果は、分子間相互作用（タンパク質では一般的ですが、小分子ではまれ）が RE 分離を改善するためにどのように利用できるかを示しています。

私たちは、LanM のいくつかの特徴を提案しました4。 まず、LanM は 4 つの EF-hand モチーフを持っています。 EF ハンドは、伝統的に CaII 結合に応答する α ヘリックスが隣接する 12 残基のカルボキシレートに富む金属結合ループで構成されます。29、Mex-LanM では、EF ハンド 1 ～ 3 は低ピコモルでランタニド(III) イオンに結合します。親和性と CaII の 108 倍の選択性により、ランタニド選択的な大規模な無秩序から秩序への構造転移が生じます4。 EF4 はマイクロモルの親和性のみで結合します。 第二に、LanM の隣接する EF ハンドは、CaII 応答性 EF ハンドタンパク質の典型的な約 25 残基ではなく、12 ～ 13 残基離れており、その結果、周囲に金属結合部位を持つ珍しい 3 ヘリックスバンドル構造が形成されます。 第三に、少なくとも 1 つの EF ハンドの 2 番目の位置にプロリンが含まれています (Mex-LanM では、4 つの EF ハンドすべてが P2 残基を特徴としています)。 最初の 2 つの基準と 200 残基未満の配列長を使用して配列データベースを検索し、696 個の推定 LanM を特定しました。 これらの配列は、配列類似性ネットワーク 30 を使用して視覚化され、Mex-LanM とは別にクラスター化されている LanM 配列を特定しました。 特に、65%の同一性閾値では、642配列の主要なクラスターから離れた配列の小さなクラスターが形成されます（図1a）。 この独占的なクラスター (ハンス クラスター) には、ハンシュレーゲリア属およびザントバクター属 (拡張データ図 1) を含むいくつかの属の細菌が含まれており、これらはすべて通性メチロトローフです 31。

a、コア LanM シーケンスのシーケンス類似性ネットワークは、Hans-LanM が別個のクラスターを形成していることを示しています。 配列類似性ネットワークには、48,647 個のエッジに接続された 696 個の LanM 配列が含まれており、BLAST E 値 1 × 10−5 および 65% の配列同一性で閾値処理されています。 ブラック ボックスは、Hans-LanM でクラスター化されたノードを囲みます。 Mex (下三角) と Hansschlegelia 内の 4 つの LanM シーケンス (上三角) は、他のノード (丸) と比較して拡大されています。 ノードの色は、シーケンスの起源となるファミリーを表します。 b、Mex-LanM と Hans-LanM の 4 つの EF ハンドの配列の比較。 EF ハンドの金属結合に標準的に関与する残基は青色で表示されます。 プロ残基は紫色です。 c、LaIIIによるHans-LanMの代表的な滴定からの円二色性スペクトル。ヘリシティを増加させる金属関連の立体配座応答を示す。 アポタンパク質は太字の黒色、LaIII 飽和タンパク質は太字の赤色です。 d、LaIII、NdIII、およびDyIII（pH 5.0）によるHans-LanMの円二色性滴定。 各点は、3 つの独立した実験からの平均 ± SD を表します。 e、Mex-LanM (黒 18) と Hans-LanM (赤) の Kd,app 値 (pH 5.0) の比較。イオン半径 7 に対してプロットされています。 3 つの独立した実験からの平均値 ± 標準誤差。

ソースデータ

Hans-LanM は、Mex-LanM との配列同一性が低く (33%) (補足図 1)、特に Mex-LanM の重要な位置である 1 番目、2 番目、9 番目の位置 (図 1b) で分岐した EF ハンド モチーフを特徴としています。 LanM23,26 およびその他の EF ハンドタンパク質 29。 したがって、Hans-LanM は、LanM における選択的ランタニド認識に不可欠な特徴を決定する機会を提供しました。

Hans-LanMは、大腸菌内で110アミノ酸のタンパク質として発現されました（補足図1）。 錯体形成研究のために、LaIII および NdIII が代表的な LRE として選択され、DyIII が代表的な HRE として選択されました。 このタンパク質は、Mex-LanM4 と同様に、誘導結合血漿質量分析法 (補足表 1) により、約 3 等量の LaIII および NdIII に結合し、わずかに少ない DyIII に結合します。 また、Mex-LanM4 と同様に、Hans-LanM は、222 nm での円二色性シグナルによって判断されるように、金属の非存在下ではヘリックス含有量をほとんど示しません (図 1c)。 予想外なことに、ハンス-LanMの完全な立体構造変化を引き起こすにはLaIIIまたはDyIIIの2当量のみで十分であり（補足図2）、3番目の結合当量は弱く、ヘリシティを増加させないことを示しています。

円二色性分光法 4 によって決定された見かけの解離定数 (Kd,app) は、競合的 RE 回収条件下での Mex-LanM の RE 対 RE、および RE 対非 RE の選択性を反映しています 6,18。 したがって、競合キレート剤 4,32 によって制御された遊離金属濃度を使用した同様の Kd,app の測定が Hans-LanM に適用されました。 結果 (図 1d および補足表 2) は、Mex-LanM の結果とは異なりました。 LaIII および NdIII が Hans-LanM に結合すると、222 nm でのモル楕円率が 2.3 倍増加します。これは化学量論的滴定で明らかな完全な構造変化です。 構造変化は協調的であり (ヒル係数、n、2、補足表 2)、Kd,app 値は同様で、それぞれ 68 および 91 pM です。 対照的に、DyIIIは化学量論的滴定においてLaIIIと同じ全体的な応答を誘導しますが（補足図2）、キレート剤緩衝DyIII滴定ではHans-LanMはより低い立体構造応答（1.8倍増加）を示します。 この違いは、DyIII 結合部位の少なくとも 1 つが非常に弱い応答性であることを示しています (Kd,app > 0.3 μM、キレーター緩衝滴定で利用可能な最高濃度)。 DyIII に対する主な応答は 2.6 nM で発生し、LRE よりも 30 倍以上高く、協力性はほとんどまたはまったくありません (n = 1.3)。 対照的に、Mex-LanM は LRE に対して中程度の優先度しか示さず（約 5 倍、図 1e、参考文献 4）、すべてのランタニドと YIII は同様の立体構造変化と協調性を誘導します 18。 Hans-LanM はカルシウム(II) に弱く反応しますが (Kd,app = 60 μM)、同様に協同性が欠如し (n = 1.0)、DyIII では部分的な構造変化が明らかです (拡張データ図 2)。 したがって、Hans-LanM は Mex-LanM よりも LRE と HRE をより強く識別し、HRE 複合体はより低い親和性、より低い協同性、およびより少ない一次構造変化を示します。

LRE-およびHRE-Hans-LanM複合体の異なる挙動は、Mex-LanMには存在しないLRE対HRE選択性のメカニズムを示唆しました。 Mex-LanM は同様に LRE および HRE と複合体を形成するモノマーであるため 4,5、LRE と HRE が Hans-LanM において異なるオリゴマー状態を誘導する可能性があると考えました。 3当量のLaIIIの存在下では、Hans-LanMはサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）カラムから11.9 kDaの予想分子量（MW）ではなく27.8 kDaで溶出し、二量体を示唆しています（補足図3）。および4a）。 NdIIIの後で徐々に始まりますが、GdIIIで急激に、見かけのMWはモノマーで予想されるものに向かって減少します（図2a、補足図4および補足表3）。 特に、GdIII より重いランタニドは、再生可能エネルギーを利用する細菌の増殖をサポートしていないようです 33,34,35。

a、分析用SEC（赤線）またはSEC-MALS（黒破線）によって決定された、REとHans-LanM複合体の見かけの分子量。 条件については補足表 1 を参照してください。 個々のデータ ポイントは 1 回の実験の結果です。 b、X線結晶構造解析によって測定されたLaIII結合Hans-LanM二量体。 LaIII イオンは緑色の球として示され、NaI イオンは灰色の球として示されます。 c、チェーン A の EF3 付近のダイマー界面の詳細図 (青い漫画)。 鎖 C の Arg100 (水色の漫画) は、鎖 A の Asp93 と 2 つの EF3 LaIII リガンド (Glu91 および Asp85) が関与する水素結合ネットワークを固定します。 これらの相互作用は二量体界面での唯一の極性接触を構成し、EF3 のランタニド結合部位の半径を制御する手段を提供します。 d、二量体界面での相互作用の概略図。 赤い破線は水素結合相互作用を示し、灰色の破線は疎水性接触を示します。 e、LaIII結合（左）およびDyIII結合（右）Hans-LanMの小角X線散乱データセットからの電子密度のDENSS投影。PyMOLで生成した二量体LaIII-Hans-LanMのリボンダイアグラムを重ねたもの結晶構造。

生理学的に関連するLREの存在下での優先二量体化をさらにサポートするために、多角度光散乱（MALS;図2aおよび補足図5）を使用してHans-LanMのRE複合体を分析しました。 LaIII、NdIII、および GdIII 錯体の MW は 22 ～ 25 kDa であり、二量体であることを示していますが、SEC データと一致して、MW は TbIII から減少し、約 15 kDa で DyIII および HoIII まで続きます (拡張データ表 1)。 CaII結合Hans-LanMも14.7 kDaの分子量を示した。 ただし、HRE-、CaII-、およびアポ Hans-LanM 複合体は単量体で予想されるよりも依然として 3 分の 1 大きいですが、このことは、これらの形態がこれらの条件下で約 2:1 の単量体/二量体比の急速な平衡状態で存在することを示唆しています。 次に、等温滴定熱量測定により、アポ、LaIII結合およびDyIII結合Hans-LanMの二量体化のKd（Kdimer）を決定しました（拡張データ表2および補足図6〜8）。 アポタンパク質と DyIII 結合タンパク質は弱く二量体化し、K ダイマー値はそれぞれ 117 μM と 60 μM であり、SEC および MALS トレースに反映されているモノマーとダイマーの比率と一致しています。 ただし、LaIIIの存在下では、二量体はきつすぎて等温滴定熱量測定で単量体化を観察できず、これはKダイマー<0.4μMであることを示しています（補足図8）。 したがって、LaIII は、DyIII よりも 100 倍以上、Hans-LanM の二量体化を促進します。

LaIII と複合体を形成した Hans-LanM の 1.8 Å 分解能の X 線結晶構造は、LRE 誘発二量体化を確認します (拡張データ図 3 および補足表 4)。 2つのLanMモノマーは頭から尾まで相互作用し（図2b）、疎水性および極性接触を通じて約600Å2の表面積を埋めます（図2c、d）。 これらの相互作用は主に、コアヘリックスα1（EF1とEF2の間）とα2（EF3とEF4の間）によって寄与される側鎖間で発生します。補足図9）。 二量体界面の残基は、4 つの金属結合部位のうち 1 つである EF3 のみと直接接触します。 各モノマーのEF3の3残基は、他のモノマーのArg100と水素結合ネットワークを形成しており（図2c）、この部位の占有および配位構造がオリゴマー状態を制御している可能性があることを示唆しています。

Hans-LanM と、LaIII、NdIII、DyIII の 3 つの等価物を含むその複合体も、小角 X 線散乱によって分析されました（補足図 10 および 11）。 小角X線散乱データから計算された溶媒エンベロープ36は、LaIII-Hans-LanMの結晶学的Hans-LanM二量体によく適合し、NdIII-Hans-LanMには十分に適合しましたが、DyIII-Hans-LanMにはあまり適合しませんでした（図2e）および補足図12〜14）。 DyIII-Hans-LanM の二量体化が弱いことは、ポロド体積などの定量的指標によっても裏付けられています (補足図 15 および 16、補足表 5 および 6)。 生化学的および構造的結果を総合すると、Hans-LanM の二量体化平衡が特定の RE 結合に強く依存していることが示されています。

LaIII-Hans-LanM の構造は、LanM の配位環境の最初の詳細な図の 1 つを提供し、実際、可逆的なランタニド認識の役割を担っている天然の生体分子も同様に示しています。 Mex-LanM5 の以前の NMR 構造では、このタンパク質の異常な折り畳みが明らかになりましたが、金属結合部位に関する分子レベルの詳細は得られませんでした。 LRE と HRE の区別の基礎を理解するために、DyIII-Hans-LanM の 1.4 Å 分解能の構造も決定しました。 最後に、NdIII-Mex-LanM の分解能 1.01 Å の構造を報告します。これは、Mex-LanM の浅い RE 選択性の傾向を正当化します 4。

LaIII-Hans-LanM では、EF1-3 は LaIII イオンによって占有されています（拡張データ図 3b-e）。 EF4は構造的に異なり、LaIIIと一致する異常な差密度を示さず、NaIでモデル化されました（補足図17a）。 ランタニド依存性メタノールデヒドロゲナーゼの構造で観察されるように、各LaIII結合部位は10配位です33、37（補足図18）。 単座Asn（N1位置）、4つの二座AspまたはGlu残基（D3、D5、E9およびE12）、および骨格カルボニル（T7またはS7）により、EF1〜3の最初の配位球が完成します（図3a）。 外因性溶媒リガンドは観察されません（補足図17b）。 配位溶媒分子の数（q）を決定するためのEuIII-Hans-LanMの発光研究では、q = 0.11が得られ、X線構造に溶媒リガンドが存在しないことと一致しています（補足図19）。

a、LaIII-Hans-LanM の EF2 (左) と EF3 (右) の拡大図。 LaIII イオンは緑色の球として示されています。 配位結合と水素結合は破線で示されています。 鎖 A によって寄与される残基は青色で示され、鎖 C によって寄与される残基 (EF3 の場合) は水色で示されます。 挿入図: LaIII-Hans-LanM (青と水色) と DyIII-Hans-LanM (灰色) の重ね合わせ。Glu91 の二座 (La) から単座 (Dy) へのカルボン酸シフトを示します。 配位および水素結合 (破線) は Dy の場合のみ示されています。 b、NdIII-Mex-LanM の代表的な金属結合部位 (EF3)。 NdIII イオンは水色の球として示されています。 溶媒分子は赤い球として示されています。

Hans-LanMのランタニド結合部位はさらに、リガンドの位置と金属結合細孔のサイズをさらに制限する可能性がある広範な第2球相互作用を共有しています（補足図20）。 この現象は EF3 で最も明白であり、EF3 ではダイマー界面が複数のリガンドを含む拡張された水素結合ネットワークを媒介します。 隣接するモノマーによって寄与される Arg100 は、EF3 の溶媒に露出した側に突き出て、2 つのカルボキシレート リガンド、Asp85 (D3) および Glu91 (E9) と接触し、それらの二座結合モードを強化します。 Arg100 は Asp93 (EF3 D11) によっても強化されていますが、これは Hans-LanM 内の EF3 に特有であり、Mex-LanM では観察されません。 最小限の置換である R100K を行うことにより、Hans-LanM 二量体化におけるこのネットワークの重要性をテストしました。 Hans-LanM（R100K）は、野生型 Hans-LanM とほぼ同じ Kd,app 値と NdIII および DyIII に対する応答を持ちましたが、LaIII の Kd,app は 2 倍弱かった（補足図 21 および補足表 7）。 SEC-MALS分析は、アポ、LaIII-およびDyIII-Hans-LanM（R100K）のMWが10〜13 kDaであることを示しました（補足図22および補足表8）。これは、特にLaIII錯体の単量体化の増加を示し、次のことを示唆しています。二量体化が弱いことが、LaIII 親和性の低下の原因である可能性があります。 Arg100-EF3ネットワークを構成する4つの残基はすべてHansクラスターで完全に保存されており（補足図23）、これらの相互作用がこれらのLanMの二量体化に寄与している可能性があることを示唆しています。

DyIII-Hans-LanM の構造は、リガンド位置の第 2 球制御の重要性を裏付けています (拡張データ図 4、補足図 24 ～ 26、補足表 9 および 10)。 DyIII – Hans-LanM の全体構造は LaIII – Hans-LanM の全体構造とほぼ重ね合わせることができ、EF1 ～ 3 の DyIII イオンの配位球は LaIII – Hans-LanM の配位球と類似しています（図 3a、挿入図）。ただし、E9 (EF3 の Glu91 など) は例外です。 この残基は、LaIII の二座配位から、より小さな DyIII イオンの単座配位に移行し、9 配位の歪んだキャップ付き正方形の反プリズム形状が得られます。 HRE イオンの配位数が低いことは、他の RE 錯体の場合と一致しています 38,39。 EF3では、このカルボン酸シフトにより、Arg100とGlu91の近位Oεの間の距離が2.9Å（LaIII-Hans-LanMの場合）から3.2Åに延長されます（補足図27）。 この第 2 球の水素結合ネットワークの再配置は、Kdimer 値における RE 依存性の違いの構造的基盤を示唆しています。

Mex-LanM の金属結合部位は Hans-LanM の金属結合部位とは大きく異なります。 Mex-LanMでは、4つのEFハンドすべてが9配位（EF1〜3）または10配位（EF4）のNdIIIイオンによって占められており、それぞれに2つの溶媒リガンドが含まれており、Hans-LanMには存在しません（図3bおよび補足図）。 28）。 金属部位あたり 2 つの溶媒分子と D9 残基への水素結合の観察により、最近の分光学的研究が検証されました 21、23、26。 EF1 ～ 3 と EF4 の配位数の違いは、D3 カルボン酸塩が EF1 ～ 3 では単座であるのに対し、EF4 では二座であるためです。 Mex-LanMのNdIII部位は、DyIII-およびLaIII-Hans-LanMで観察される9配位および10配位を共有していますが、構造的にはカルモジュリンの7配位のCaII結合部位に似ています（補足図18）。 カルモジュリンと比較した Mex-LanM の配位数の増加は、D5 と追加の溶媒リガンドの二座配位に起因します。 これらの類似点は、CaII に比べて RE に対する LanM のユニークな 108 倍の選択性の多くが、第 2 配位圏およびその他のより遠位の相互作用における微妙な違いに起因することを示唆しています。 最後に、Hans-LanMの専らタンパク質由来の最初の配位球は、特にE9による配位により、より拡張された水素結合ネットワークをもたらし（補足図20および29）、おそらく結合部位の半径の制御を強化します。 したがって、この構造は、Mex-LanM および Hans-LanM の並外れた RE 対非 RE 選択性を合理化すると同時に、LRE 対 HRE 選択性の違いも説明します。

Hans-LanM の LRE 複合体と HRE 複合体間の安定性と構造の違いは、Hans-LanM (野生型および/または R100K) が RE/RE 分離において Mex-LanM より優れていることを示唆しました。 私たちは、永久磁石に使用される NdIII と DyIII の RE ペアの分離に焦点を当てました。 まず、以前に Mex-LanM6 の脱着剤として使用されていた野生型 Hans-LanM および Hans-LanM(R100K) RE 複合体のクエン酸塩に対する安定性をアッセイしました。 RE-Hans-LanM複合体は、より低い親和性に基づいて予想されるように、一般にMex-LanMの複合体よりもクエン酸塩に対する安定性が低くなります（図1e）が、NdIII-Hans-LanMとDyIII-Hans-の間の安定性の違いは、 LanM複合体（Hans-LanMの2つのTrp残基の蛍光によって報告されるように、各金属の50％の脱離に必要なクエン酸濃度の比（[クエン酸]1/2）として表されます（補足図30））は、 Mex-LanM複合体の場合（図4a、補足表11および拡張データ図5）。 さらに、R100K 置換は Hans-LanM の LaIII 錯体をクエン酸に対して著しく不安定化しますが、NdIII 錯体にはわずかに影響を与えるだけで、DyIII 錯体には影響を与えません。 この結果は、二量体化がハンス-LanMのLRE複合体（特にLaIII複合体）を選択的に安定化し、この因子がR100K置換によって無効になることを裏付ける。 クエン酸よりも弱いキレート剤であるマロン酸を使用すると、10〜100 mMのキレート剤でHans-LanMとR100Kの両方からDyIIIを容易に脱着でき、NdIIIの顕著な脱離はなく、NdIII/DyIIIの分離条件が示唆されています（図4b）。

a、Hans-LanM と R100K バリアントは、クエン酸塩による脱離に対して、Mex-LanM よりも Nd 対 Dy 錯体の安定性において大きな差を示します。 3 つの独立した試験の平均値 ± 標準誤差。 **Hans-LanM と Hans-LanM(R100K) (20 µM タンパク質) の間の LaIII の [クエン酸]1/2 の有意な差は、LaIII 複合体の安定性の二量体化の影響を示しています (P < 0.01、Bonferroni 事後分散分析)。テスト）。 Mex-LanM の Nd および Dy データは参考文献から。 6. b、pH 5.0でのHans-LanMおよびR100Kバリアント（λex = 280 nm、λem = 333 nm）の分光蛍光滴定。2:1金属-タンパク質複合体のマロン酸誘導性脱着を示します。 各条件の単一試験である R100K を除く 3 つの独立した試験の平均 ± sem。 c、固定化されたHans-LanM、Hans-LanM（R100K）およびMex-LanMの分配係数（pH 5.0、各RE、LaIII〜DyIII約0.33 mM）の比較。 各点は、3 つの独立した試験の平均 ± SD を表します。 ｄ、固定化Ｈａｎｓ－ＬａｎＭ（Ｒ１００Ｋ）を使用したＮｄＩＩＩ／ＤｙＩＩＩの９５：５混合物の分離、およびマロン酸塩の３段階濃度とその後のｐＨ１．５のＨＣｌの脱着スキーム。 １つのベッドの体積は０．７ｍｌであった。

ソースデータ

二量体化による RE 対 RE 選択性の 2 倍の調整は小さいように思えるかもしれませんが、そのような違いにより分離段階の数が減り、分離プロセスの効率が向上する機会が得られます 3,12。 したがって、Hans-LanM および R100K バリアントは、前述のように 6 、マレイミド官能化アガロースビーズ上のカルボキシ末端 Cys 残基を介して固定化され、NdIII/DyIII 分離についてテストされました。 溶液中とは異なり、固定化されたHans-LanMは約1当量のREに結合し、Mex-LanM6およびHans-LanM（R100K）の2当量と比較されました（補足図31）。 Hans-LanM と R100K は、平衡状態における混合 RE 溶液のカラム上分布比 (D) によって決定されるように、La-Gd 範囲では同様の分離能力を示しましたが、Gd-Dy 範囲では R100K の方が優れた分離能力を示しました (図.4c、拡張データ表 3 および補足表 12 ～ 14)。 これらの Nd/Dy 分離係数は、Mex-LanM のほぼ 2 倍 (Hans-LanM) および 3 倍 (Hans-LanM(R100K)) です (拡張データ表 3)。 固定化された Hans-LanM は、5% ジスプロシウムと 95% ネオジムのモデル電子廃棄物混合物を破過容量の 90% までロードし、図 4b に従って、短い段階的なマロン酸勾配で溶出し、続いて pH 1.5 を使用して完全に脱着しました。塩酸。 単一の精製段階で、Dy の純度は 5% から 83% に向上し、Nd は 99.8% の純度で回収されました (どちらも収率 > 98%、拡張データ図 6)。 これは、最初の分離段階で 50% の純度しか達成できず、>98% の純度を得るには 2 番目の段階が必要だった同等の Mex-LanM ベースのプロセスを大幅に上回りました6。 固定化された R100K バリアントはさらに優れた性能を発揮し、単一段階で純度 >98%、収率 >99% までの DyIII と NdIII のベースライン分離を達成しました (図 4d)。 R100K バリアントの優れたパフォーマンスは予想外であり、この固定化密度ではカラム上に機能的ダイマーが存在する可能性が低いことを示している可能性があります (議論については拡張データ図 6 のキャプションを参照)。 したがって、Hans-LanM の二量体化機構の特徴付けにより、Mex-LanM と比較して性能が大幅に向上したにもかかわらず、カラム上で二量体化現象を十分に活用するには、例えば、単一のポリペプチド鎖上で 2 つのモノマーをテザリングすることが考えられ、これについては現在研究中です。

Hans-LanM の金属感受性二量体化機構の生化学的および構造的特徴付けは、生物学における LRE 対 HRE 選択性の新しいアロステリック機構を提供し、合成ランタニド錯体 11 および人工遷移金属結合タンパク質 40 から最近出現した二量体依存金属認識の概念を拡張します。これらの原理が自然界に組み込まれていることを示しています。 私たちの研究は、二量体化の強さ、したがって金属の選択性を合理的に調整できることも示しています。 Hans-LanM は、カラム上の濃度 (約 3 mM) ではなく、生化学アッセイの濃度 (10 ～ 20 μM) に近い生理学的タンパク質濃度で LRE 選択的二量体化を進化させました。 したがって、分離プロセスにおける二量体化の活用は、二量体化界面での疎水性相互作用を調整するなど、二量体化の感度をより高濃度領域にシフトすることによって支援されると考えられます。 さらに、我々の研究では、同一性が 33% 程度の LanM は容易に予測できるにもかかわらず、金属選択性に有用な違いがあることが証明されています。 この多様性をさらに調査すると、RE分離を調整するためのさらなるメカニズムが明らかになる可能性があります。 最後に、Hans-LanM の溶媒を排除した配位球は、RE/アクチニド分離 23、発光ベースのセンシング 21,26、および加水分解しやすいイオンの安定化において、Mex-LanM よりも優れた性能を発揮するはずです。 生物学的 f 要素認識の配位および超分子原理の継続的な特性評価は、より高い RE 対 RE 選択性を備えたリガンドの設計と、新しい RE 分離プロセスでのその実装を刺激するでしょう。

詳細については、「補足メソッド」を参照してください。

M. extorquens AM1 からの LanM の配列をクエリとして使用し、国立バイオテクノロジー情報センターの非重複タンパク質配列 (nr) およびメタゲノムタンパク質 (env_nr) データベースに対して収束するまで PSI-BLAST 検索を実行しました 41。 次に、得られた 3,047 個のタンパク質配列から、長さが 200 残基未満、14 残基未満で区切られた少なくとも 1 対の EF ハンド、および 4 つの EF ハンドを持つものを手動で精選しました。 LanM 配列のシグナルペプチドは、SignalP (v6.0)42 を使用して予測され、配列をさらに分析する前に削除されました。

Enzyme Function Initiative-酵素類似性ツールを使用して、E 値閾値 1 × 10−5 ですべてのペプチド配列ペア間の類似性を計算しました (参考文献 30)。 次に、696 個のノードと 241,853 個のエッジからなる配列類似性ネットワークが構築され、Cytoscape (v3.9.1)43 による有機レイアウトを使用して調査され、R (v4.1.0)44 で視覚化されました。 エッジ パーセンテージ同一性のしきい値を 40% から 90% まで徐々に増加させて、個別のクラスターを生成しました。

LanM シーケンスは、MUSCLE (v5.1)45 をデフォルトのパラメーターで使用してアラインメントされました。 系統発生の構築に使用されるモデルは、IQ-TREE (v2.2.0.3)46,47 の ModelFinder を使用し、--mset を Beast2 に設定して選択されました。 ベイジアン系統発生は、BEAST (v2.6.7)48 を使用してこれらの結果に基づいて生成されました。 得られた系統発生は、107 世代を使用して 25% のバーンインを破棄して評価され、ggtree (v3.2.1)49 を使用して視覚化されました。

天然の 23 残基シグナルペプチドを持たない大腸菌での発現に最適化されたコドンである Hans-LanM をコードする遺伝子 (補足表 15 を参照) は、Twist Bioscience から入手し、制限部位 NdeI/ を使用して pET-29b(+) に挿入しました。 XhoI。 Hans-LanM を 2 L スケールで過剰発現させ、Mex-LanM50 用に確立されたプロトコールを使用して精製しましたが、1 つの変更を加えました。最終 SEC ステップの後、タンパク質を 5 ml に濃縮し、500 ml の 5 g Chelex 100 に対して透析しました。 30 mM HEPES、100 mM KCl、5% グリセロール、pH 8.4、CaII および微量金属汚染物質を除去します。 この手順により、約 15 ml の 550 μM タンパク質が得られましたが、これ以上は濃縮されませんでした。 最終収量は、培養物１リットルあたり４５ｍｇのタンパク質であった。 タンパク質濃度は、ExPASy ProtParam ツール 51 に基づいて、11,000 M-1 cm-1 の吸光係数を使用して計算されました。 Hans-LanM(R100K) を同じ手順を使用して精製すると、培養物 1 リットルあたり 30 mg のタンパク質が得られました。

Hans-LanM の円二色性スペクトルは、特に記載のない限り、前述のとおり 32、Chelex 100 処理バッファー A (20 mM 酢酸塩、100 mM KCl、pH 5.0) 中で 15 μM (モノマー濃度) で収集しました。 緩衝金属溶液は前述のように調製されました4、23、25、32。 追加の詳細については、補足情報を参照してください。

野生型Hans-LanMのサンプルは、Hans-LanMの濃縮ストック（550μM）1.0mlに3.0当量の金属をゆっくりと（一度に0.5当量、その後混合）加えることによって調製した。 これらのタンパク質濃度では、LRE サンプル (LaIII など) ではわずかな沈殿が観察されましたが、HRE サンプル (DyIII など) では顕著な沈殿が観察されました。 サンプルを 12,000g で 2 分間遠心分離して沈殿を除去し、緩衝液 B (30 mM MOPS、100 mM KCl) 中でゲル濾過クロマトグラフィー (HiLoad 10/300 Superdex 75 pg、1 ml ループ、0.8 ml min-1) を使用して精製しました。 、５％グリセロール、ｐＨ７．０）。 Hans-LanM を含むピーク (溶出量 12.0 ～ 15.0 ml の範囲) を高分子量凝集ピークを避けるために収集し、114 μM ～ 128 μM (1.37 ～ 1.53 mg ml-1) の範囲の金属化 Hans-LanM 2.0 ml を得ました。 ）。

Hans-LanM(R100K) のサンプルは、金属を添加しても高分子量種を形成したり、沈殿したりしません。 このタンパク質のサンプルを調製するために、500 μM タンパク質溶液を、0.75 mM の特定の RECl3 を含む緩衝液 B で 250 μM (3 mg ml-1) に希釈し、3 mg ml-1 タンパク質の最終溶液を得ました。 :3 の金属比。これは SEC-MALS によって直接分析されました。

カルシウム条件では、タンパク質を 250 μM (3 mg ml-1) に希釈し、5 mM CaCl2 を添加し、サンプルを室温で 1 時間インキュベートしました。 SEC-MALS に使用したバッファーは、5 mM CaCl2 も含まれていることを除いて、上記と同じでした。

SEC-MALS 実験は、オートサンプラーとフラクションコレクターを備えた Agilent 1260 Infinity II HPLC システムを使用して実施されました。Wyatt SEC 親水性カラムには 5 µm シリカビーズ、孔径 100 Å、寸法 7.8 × 300 mm が装備されていました。 Wyatt Technology DAWN MALS および Wyatt Optilab 屈折率検出器を使用して、カラムから溶出するピークのモル質量を分析しました。 SEC-MALS システムはバッファー B で 5 時間平衡化されました。システムは同じバッファー中のウシ血清アルブミン (モノマー分子量: 66 kDa) で校正され、MALS と屈折率検出器の正規化と位置合わせが行われました。 15 μl の各サンプルを 0.8 ml min-1 の流速で、25 分のクロマトグラム実行時間で注入しました。 データは、ASTRA ソフトウェア (Wyatt) を使用して分析されました。 小角 X 線散乱 (SAXS) 分析が必要な場合は、150 μl のタンパク質 (約 4 mg ml-1) を注入して 2 回目の実行を実行し、メイン ピークの 200 μl 画分を収集しました。 その後、BioSAXS データを 3 回収集しました。

apo、LaIII結合およびDyIII結合Hans-LanMの二量体の解離定数は、濃縮タンパク質ストックを希釈添加し、その後TA Instruments Low-volume Auto Affinity等温滴定熱量計で等温滴定熱量測定を使用して決定しました。 シリンジには 300 μM タンパク質 (アポまたは 2 等量の DyIII 結合) または 150 μM または 540 μM (2 等量の LaIII 結合) が含まれており、セルには 185 μl の対応する緩衝液 (30 mM MOPS、100 mM KCl、pH 7.0) が含まれていました。 ）。 滴定は 30 °C で実行されました。 滴定は、特に断りのない限り、最初の 0.2 μl 注入、その後の 17 × 2 μl 注入からなり、注入間の平衡時間は 125 rpm で 180 秒でした。 データは、二量体解離モデルを使用する NanoAnalyze を使用してフィッティングされ、二量体解離定数 (Kdimer)、解離エンタルピー (ΔH)、および解離エントロピー (ΔS) が得られました。 すべてのパラメータは拡張データ表 2 に示されています。

Kdimer は、平衡 D \(\rightleftharpoons \) 2M の解離定数として定義され、Kdimer = [M]2/[D] となります。ここで、[D] は二量体の濃度、[M] は濃度ですモノマーの総タンパク質濃度 [P] (モノマーの吸光係数を使用して測定) は、[P] = [M] + 2[D] で求められます。 したがって、Kdimer = 2[M]2/([P] − [M]) または

この式は、等温滴定熱量測定実験から計算された Kdimer 値と SEC-MALS トレースからの [P] を使用して、SEC-MALS 実験中にモノマーとダイマーの濃度を推定するために使用できます。 この方程式は、SEC-MALS データを考慮して、LaIII 結合タンパク質の可能な最大 Kdimer を推定するために使用することもできます。

SAXS データは、補足方法に記載されている装置および条件下で、補足表 5 に示されているタンパク質濃度で、RE 複合体 Hans-LanM 上で収集されました。

前方散乱 I(0) と回転半径 (Rg) は補足表 5 にリストされており、非常に小さな角度 (q < 1.3/Rg) で強度が I( q) = I(0)exp[−1/3(qRg)2]。 LaIII、NdIII、DyIII 結合条件では、これは結晶学的二量体の計算サイズ 17.9 Å と一致します。 分子量は、ウシ血清アルブミン標準物質の SAXS データとの比較を使用して推定されました。 データ ファイルは、ATSAS ソフトウェア 52 を使用して、ギニエ Rg、最大粒子寸法 (Dmax)、ギニエ フィット、クラッキー プロット、およびペア距離分布関数について分析されました。 ATSAS 内の GNOM を使用してペア距離分布関数 P(r) を計算し、そこから Rg と Dmax を決定しました。 溶媒エンベロープは DENSS36 を使用して計算されました。 構築されたモデルの理論的な散乱プロファイルが計算され、CRYSOL53 を使用して実験的な散乱データに適合されました。 OLIGOMER54 を使用して、モノマーとダイマーの割合を推定しました。

Hans-LanM (2 ml、1.16 mM、緩衝液 B) に、沈殿を最小限に抑えるために、3.0 当量の LaCl3 または DyCl3 を混合しながら一度に 0.5 当量ずつゆっくりと加えました。 沈殿物を12,000gで2分間遠心分離することにより除去した。 可溶性凝集物をすべて除去し、ゲル濾過クロマトグラフィー (HiLoad 16/600 Superdex 75 pg、1 ml ループ、0.75 ml min) によってタンパク質をグリセロールを含まない緩衝液 (緩衝液 C: 30 mM MOPS、50 mM KCl、pH 7.0) に交換しました。 −1)。 70 ～ 85 ml の範囲のピークをプールし、画分を最終濃度約 1.3 mM で約 500 μl に濃縮しました。

Mex-LanM は前述のとおりに精製し 50、結晶化前に緩衝液 C に交換しました。 タンパク質には 3.5 当量の NdIII (NdCl3) がロードされました。

回折データセットは、Life Sciences Collaborative Access Team ID-G ビームラインで収集され、HKL2000 パッケージで処理されました55。 すべての構造において、位相情報は、HySS58 で同定されたランタニドイオンが異常散乱体として使用される、単一波長異常回折法を通じて phenix.autosol56,57 で取得されました。 初期モデルは phenix.autobuild59 で生成され、その後 Coot60 と phenix.refine61 で手動での修正と改良が行われました。 モデル改良の最終段階では、すべてのランタニド サイトの異方性変位パラメータと占有率が改良されました62。 モデルの検証は、Molprobity サーバーを使用して実行されました63。 図は、PyMOL 分子グラフィック ソフトウェア パッケージ (Schrödinger, LLC) を使用して作成されました。

結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して得られました。この方法では、1μlのタンパク質溶液（15 mg ml-1）を1μlの10 mMクエン酸三ナトリウム、pH 7.0、および27％（w/v）PEGと混合しました。 Hampton Research の 24 ウェル プレート (カタログ番号 HR1-002) に室温で 6000 μl を入れます。 ３日で薄い板状の結晶が現れた。 データ収集に適した結晶をレーヨンループに取り付け、10% エチレングリコールを補充したウェル溶液からなる凍結保護剤溶液に短時間浸し、液体 N2 中で急速冷凍しました。

LaIII を担持した Hans-LanM は、非対称ユニットに 4 つのモノマーを含む P21 空間群 (β = 90.024°) で結晶化しました。 初期の性能指数とベイズ相関係数は、それぞれ 0.563 と 0.56 でした64。 最終モデルは、各鎖の残基 24 ～ 133、LaIII イオン 12 個 (EF ハンドの最初、2 番目、および 3 番目の鎖ごとに 3 個)、NaI イオン 4 個 (4 番目の EF ハンドの鎖ごとに 1 個)、水分子 273 個、および 2 個で構成されます。クエン酸の分子。 ラマチャンドラン統計分析によって示されるように、モデル化された残基のうち、100% が許容領域または優先領域にあります。

結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して得られました。この方法では、1μlのタンパク質溶液（15 mg ml-1）を1μlの250μMクエン酸三ナトリウム、pH 7.0、および27％（w/v）と混合しました。 Hampton Research の 24 ウェル プレート内の PEG 6000、室温。 １ヶ月以内に薄い板状の結晶が現れた。 データ収集に適した結晶をレーヨンループに取り付け、Hampton Research のパーフルオロポリエーテルクライオオイル (カタログ番号 HR2-814) を補充したウェル溶液からなる凍結保護剤溶液に短時間浸し、液体 N2 中で急速冷凍しました。

DyIII を担持した Hans-LanM は、非対称ユニット内の 4 つのモノマーを含む P21 空間群 (β = 93.567°) で結晶化しました。 初期の性能指数とベイズ相関係数は、それぞれ 0.748 と 0.58 でした64。 最終モデルは、各鎖の残基 24 ～ 133 (残基 34 ～ 38 をモデル化できない鎖 D を除く)、14 個の DyIII イオン (鎖 A および D に 4 個、2 番目、3 番目、および 4 番目の EF ハンドに 3 個) で構成されます。鎖 B と C) および 656 個の水分子。 ラマチャンドラン統計分析によって示されるように、モデル化された残基のうち、100% が許容領域または優先領域にあります。

異常なデータセットの収集については、補足方法で説明されています。

結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して得られました。この方法では、1μlのタンパク質溶液（35mg ml-1）を1μlの0.1M硫酸アンモニウム、0.1MトリスpH7.5、および20％（w/v）と混合しました。 ) Hampton Research の 24 ウェル プレート中の PEG 1500、室温。 ６ヶ月以内に薄い板状の結晶が現れた。 データ収集に適した結晶をレーヨンループに取り付け、Hampton Research のパーフルオロポリエーテルクライオオイルを補充したウェル溶液からなる凍結保護剤溶液に短時間浸し、液体 N2 中で急速冷凍しました。

NdIII を担持した Mex-LanM は、非対称ユニットに 1 つのモノマーを含む P212121 空間群で結晶化しました。 初期の性能指数とベイズ相関係数は、それぞれ 0.799 と 0.56 でした64。 最終モデルは、残基 29 ～ 133、4 つの NdIII イオン、および 171 個の水分子で構成されます。 ラマチャンドラン統計分析によって示されるように、モデル化された残基のうち、100% が許容領域または優先領域にあります。

すべての蛍光データは、励起アームにダブルモノクロメーター、発光アームにシングルモノクロメーターを備えた構成 75-21-C (Horiba Scientific) の Fluorolog-QM 蛍光光度計を使用して収集しました。 定常状態測定の光源として 75 W キセノン ランプを使用し、時間分解測定にはパルス キセノン ランプを使用しました。 10 ミリメートルの石英分光蛍光分析キュベット (Starna Cells、18F-Q-10-GL14-S) を使用して、励起経路に対して 90° でデータを収集しました。

蛍光寿命の測定は、確立された方法を使用して実行されました26、66。 つまり、2当量のEuIIIを添加したHans-LanM溶液（合計4.5ml）を100％H2Oマトリックス（緩衝液：25mM HEPES、75mM KCl、pH 7.0）中で調製した。 この最初のタンパク質混合物の半分 (2.25 ml) を将来の使用のために保持し、残りを凍結乾燥して H2O を除去し、99.9% D2O に再懸濁することを 2 回行って D2O に交換しました。 得られたタンパク質溶液(100% H2Oおよび約99% D2O中)を様々な比率で混合して、D2O含量が0%、25%、50%および75%になるようにしました。 タンパク質濃度は 20 μM でした。 各サンプルについて、2,500 μs の時間範囲にわたって 5,000 ショットで発光減衰時定数 (τ) を測定しました (λex = 394 nm、λem = 615 nm)。 τは、FelixFL Powerfit-10 ソフトウェア (Horiba Scientific) を使用し、単一の指数関数的フィットを使用して決定されました。 1/τ を D2O の組成百分率に対してプロットし、得られた直線の傾き (m) を決定しました。 q 値は、参考文献から次の式を使用して決定されました。 67:

ここで、τ−1H2O と τ−1D2O は、それぞれ 100% H2O と D2O の時定数の逆数です (後者は近似直線の方程式を使用して外挿されます) (単位は ms–1)。 Hans-LanM 結晶構造に基づくと、nOH = 0、nNH = 0、および nO-CNH = 1 (金属配位 Asn 残基に起因)。 この方程式は次のように単純化されます。

蛍光競合実験のために、20μM Hans-LanMまたはR100K変異体の溶液を、2当量の金属(40μM)を含む緩衝液A(pH5.0)中で調製した。 蛍光発光スペクトルは、設定: λex = 278 nm、λem 300 ～ 420 nm、積分時間 = 0.5 秒、ステップ サイズ = 1 nm で収集されました。 滴定は、少なくとも 0.6 μl の滴定剤 (10 mM ～ 1 M クエン酸またはマロン酸の濃縮ストック溶液、pH 5.0) を加えて実行しました。 スペクトルは希釈のために補正されました。 各実験は 3 回繰り返して実行されました。

Hans-LanM(R100K)-Cys は、Mex-LanM-Cys (参考文献 6) について記載されているように発現および精製され、最終収量は培養物 1 リットルあたり 50 mg のタンパク質でした。 Hans-LanM-Cys の場合、タンパク質は、SEC ステップが還元緩衝液 (30 mM MOPS) を使用して実行されたことを除き、前述の Mex-LanM-Cys 精製に透析ステップを除いた上記と同じ修飾を組み込むことによって精製されました。 、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．０）と５ｍＭ ＥＤＴＡを混合し、固定化前に液体Ｎ２下で凍結させた。

アミン官能化アガロースビーズのマレイミド官能化については以前に記載されています6。 詳細については、補足情報を参照してください。

Hans-LanM(R100K) の固定化は、以前に説明したようにチオール-マレイミド結合反応を使用して実行されました6。 Hans-LanM の場合、最終タンパク質濃度約 0.4 mM (8 ml) を 1 ml のマレイミド - マイクロビーズと混合し、結合反応を室温で 16 時間実行しました。 結合していないHans-LanMをカップリング緩衝液で洗浄することにより除去し、その後の試験のためにHans-LanMマイクロビーズをカップリング緩衝液中に保存した。 Hans-LanM 固定化収率を定量化するために、Pierce BCA Protein Assay (ThermoFisher Scientific) を使用して、前述のように結合反応の前後で反応溶液中の LanM 濃度を測定しました。

LanM 固定化マイクロビーズを脱イオン水で洗浄しました。 フィード溶液 (5 ml、等モル REs La-Dy、合計 3 mM、pH 5.0) を 1 ml のマイクロビーズに添加し、2 時間インキュベートしました。 平衡状態にある液体を収集し、誘導結合プラズマ質量分析法により RE 濃度を [M]ad として測定しました。 次いで、４ｍｌの０．１Ｍ ＨＣｌを使用してマイクロビーズからＲＥを脱着し、濃度を誘導結合プラズマ質量分析法により［Ｍ］ｄｅとして測定した。

LanM 相と溶液相の間の RE 分配係数 (D) は次のように計算されました。

ここで、[M]LanM および [M]Liquid は、それぞれ平衡状態における LanM 相および溶液相中の各金属イオンのモル濃度です。 アガロースマイクロビーズに吸収された遊離液体を考慮して、次の補正を適用しました。[M]液体 = [M]ad; [M]LanM = (4 × [M]de – [M]ad)/4。

分離係数は次のように定義されます。

ここで、DRE1 と DRE2 は、それぞれ RE1 と RE2 の分配係数です。

以前の研究6で説明したように、カラムを充填して実行し、金属濃度を分析しました。 詳細については、補足メソッドを参照してください。

RE ペア分離実験の場合、金属イオンの純度と収率は次のように定義されます。

ここで、CRE1 と CRE2 はそれぞれ RE1 と RE2 のモル濃度です。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

すべてのデータは本文または補足情報で入手できます。 座標は、アクセッションコード 8DQ2 (LaIII-Hans-LanM)、8FNR (DyII-Hans-LanM)、および 8FNS (NdIII-Mex-LanM) で Protein Data Bank に寄託されています。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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リファレンスをダウンロードする

この研究は主にエネルギー省 (DOE) の助成金 DE-SC0021007 (JAC へ) と NSF 助成金 CHE-1945015 (JAC へ) によって財政的に支援され、それぞれ Hans-LanM と Mex-LanM の研究を支援しました。 AKBは国立衛生研究所の助成金GM119707を認め、C.-YLはジェーン・コフィン・チャイルド記念医学研究基金からのフェローシップを認めている。 DMP、CSK-Y。 ZDとZDは、DOE、エネルギー効率・再生可能エネルギー局、先端材料・製造技術局が資金提供するエネルギーイノベーションハブであるCritical Materials Instituteからの財政支援を認めている。 この研究の一部は、DOE の後援の下、契約 DEAC52-07NA27344 (LLNL-JRNL-840467) に基づいてローレンス リバモア国立研究所によって実施されました。 この研究では、契約番号 DE-AC02-06CH11357 に基づいてアルゴンヌ国立研究所が運営する DOE 科学局ユーザー施設である Advanced Photon Source のリソースを使用しました。 ライフ サイエンス コラボレーション アクセス チーム セクター 21 の使用は、ミシガン経済開発公社およびミシガン テクノロジー トライコリドー (助成金 085P1000817) によって支援されました。 NHY は、国立衛生研究所 SIG が等温滴定熱量測定装置に対して S10-OD0215145、SAXS 装置に対して S10-OD028589、および SEC-MALS-動的光散乱システムに対して S10-OD030490 を受賞したことを認めます。 実験の支援については J. Fecko、議論については Y. Jiao と G. Deblonde に感謝します。

ペンシルベニア州立大学化学科、ユニバーシティパーク、ペンシルバニア州、米国

ジョセフ・A・マトックス、ジョナサン・J・ユング、チーユン・リン、エミリー・R・フェザーストン、ティモシー・A・ハミルトン、エイミー・K・ボアル、ジョセフ・A・コトルヴォ・ジュニア

米国カリフォルニア州リバモア、ローレンス・リバモア国立研究所、物理・生命科学部門臨界材料研究所

ツィイェ・ドン、クリスティーナ・S・カンユン、ダン・M・パーク

ハック生命科学研究所、ペンシルベニア州立大学、ユニバーシティパーク、ペンシルバニア州、米国

ニーラ・H・イェナワール

ペンシルバニア州立大学、ユニバーシティパーク、ペンシルバニア州、米国生化学および分子生物学部

エイミー・K・ボール

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JAC は Hans-LanM を特定し、研究を考案し、指揮しました。 JAM は Hans-LanM を精製し、ほとんどの生化学分析を実施しました。TAHJJJ の支援を受けてタンパク質を結晶化し、JJJ と C.-YL は AKBNHY からの情報をもとに構造を解明し、SAXS 研究を実施し、いくつかの生物物理学的データ収集を監督しました。 ERF精製Mex-LanM。 CSK-Y. バイオインフォマティクス解析を実施しました。 ZD は DMPJAM、NHY、AKB、JAC からの意見を取り入れて金属分離実験を実施し、すべての著者からの意見を取り入れて論文を執筆しました。 著者全員が最終原稿を編集し、承認しました。

Dan M. Park、Amie K. Boal、または Joseph A. Cotruvo Jr. への通信

JAM、JJJ、C.-YL、ZD、ERF、CSK-Y.、DMP、AKB、および JAC は、この研究に基づいてペンシルベニア州立大学によって提出された特許出願の発明者です。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた Scott Banta と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

Hans クラスターには、Hansschlegelia 属、Ancilobacter 属、Meticopila 属、Oharaeibacter 属、Starkeya 属、および Xanthobacter 属の細菌の LanM が含まれます。 これらの属はこのクラスターに限定されていますが、科レベルのメンバーはネットワーク全体に分散しており、1 つの Xanthobacteraceae と 42 の Mmethylocystaceae が含まれています。

DyIII (最大 0.3 μM) と CaII (最大 5.5 mM) は両方とも、NdIII および LaIII によって誘導される立体構造変化と比較して、タンパク質に同様の不完全な立体構造変化を誘導します。 a の右側のパネルのデータは、左側のパネルのプロットを生成するために使用された 3 つのデータセットからの代表的な滴定です。 b と c のデータは、図 1d のプロットを生成するために使用された 3 つのデータセットからの代表的な滴定です。 条件: 15 μM タンパク質、20 mM 酢酸塩、100 mM KCl、10 mM EDTA (Ca および Nd 滴定用) または EGTA (Dy 滴定用)、0 ～ 10 mM 金属イオン。 (a、左パネル) の各データ ポイントは、3 つの独立した測定の平均 ± SD です。

ソースデータ

a, 非対称ユニットの全体構造。これは、結晶化溶液からの 2 つの Hans-LanM 二量体と 2 つのクエン酸分子から構成されます。 二量体の各単量体の構造は、EF-ハンド 2 と 3 が対になり、EF-ハンド 1 と 4 が対になった YIII 結合 Mex-LanM の NMR 溶液構造と一致します5。 b–e、LaIII-Hans-LanM の 4 つの EF ハンドにおける金属配位の詳細。 EF ハンド 1、2、および 3 の LaIII イオンの配位球は、N1 (単座) の側鎖 Oδ、D3、D5、E9、および E12 (すべて二座) のカルボキシレート側鎖、およびS7 (EF1) または T7 (EF2 および EF3) の主鎖カルボニル、総配位数 10。すべての LaIII 配位子の距離は 2.5 ～ 2.7 Å です。 10 配位 LaIII の結晶半径は Shannon によって 1.41 Å と与えられ、7 6 配位 O2- の半径として 1.26 Å と与えられ、LaIII-O 距離は 2.57 Å と推定され、我々の結果と一致しています。 EF4 の金属イオンは、金属-配位子の距離が短く、配位数が低く、結晶化溶液中にナトリウムが存在するため、NaI としてモデル化されました。 CaII はタンパク質精製の初期に存在していたので、完全に除外することはできません。 ただし、タンパク質は精製の最後に Chelex で処理され、結晶学的データは CheckMyMetal サーバーによって決定された NaI 割り当てと一致しました65。 このイオンは、単座 D1、N3、および D5 側鎖、二座 E12 側鎖、Lys113 の主鎖カルボニル、および単一の溶媒分子によって、歪んだ五角両錐構造で配位され、総配位数は 7 になります。 NaI タンパク質リガンドの距離は次のとおりです。 2.3 ～ 2.5 Å、溶媒分子は 2.7 Å。 Mex-LanM の場合、生化学データ 4,26 および NMR 分光法 5 も、EF4 がランタニドの結合が不十分な部位であることを裏付けており、NMR 溶液状態構造では金属イオンなしでモデル化されました 5。

a, 鎖 A と B で構成される非対称ユニットの二量体の 1 つ。EF4 は予想外に DyIII で占有されているのに対し、EF1 は鎖 A のみで占有されていることに注意してください。 b, 2 つの Hans-LanM で構成される非対称ユニットの全体構造二量体。 LaIII-Hans-LanM 構造とは異なり、DyIII-Hans-LanM では 2 つの二量体と各二量体内の単量体に大きな違いが見られます。 EF2-4 はすべてのチェーンで DyIII によって占有されていますが、EF1 はチェーン A でのみ占有および順序付けされています。 チェーン B と C では、EF ハンドに金属イオンが結合されておらず、チェーン D では、DyIII イオンが結合されていますが、EF1 の最初の 5 残基 (Asn34 – Asp38) はモデル化できませんでした。 DyIII を 4 つの EF ハンドすべてにモデル化するという決定は、異常回折データセットによって裏付けられています (補足表 9-10、補足図 25-26)。 生化学データは、溶液中では少なくとも1つのDyIII結合部位が弱いことを示唆しており（図1dおよび補足図2を参照）、EF2 / 3がより強固な結合部位であるというMex-LanMの研究に基づいている可能性があります。 この提案は、Dy の異常データ (補足表 10) によって裏付けられており、弱い金属結合部位の占有は、結晶解析に使用される高タンパク質濃度に起因すると考えられます。 c、DyIII-Hans-LanMのEFハンドにおける金属配位の詳細。 上の行には、非対称ユニット内の 3 つの異なる EF1 構造が示されています。 鎖 A のみに、EF1 金属部位が EF2 および EF3 の部位とほぼ同一です (LaIII-Hans-LanM とは対照的に、EF1-3 部位は非常に類似しています、拡張データ図 3)。 EF1 (鎖 A)、EF2、および EF3 では、E9​​ 残基 (Glu42、Glu66、および Glu91) が単座配位に移行し、9 配位となることを除いて、配位リガンドは LaIII-Hans-LanM と同じです。 。 DyIII による配位数の低下はランタニドの収縮と一致し 68,69、他の配位子でも観察されます (最近の例の 1 つとして、参考文献 39)。 DyIII 配位子の距離はほとんど 2.3 ～ 2.5 Å で、LaIII-Hans-LanM よりも約 0.2 Å 短くなります。 この観察と一致して、9 配位の DyIII の結晶半径は Shannon7 によって 1.22 Å と与えられており、10 配位の LaIII よりも 0.19 Å 短いです (拡張データ図 3)。 9 番目の Glu 残基のカルボキシレート シフトは、この位置が他の EF ハンド タンパク質のゲート親和性と選択性にとって重要であるため、注目に値します 70。 EF4 では、DyIII は五角両錐形の 7 配位であり、LaIII-Hans のナトリウム部位に似ていますが、金属配位子の距離がわずかに短くなります (2.2 ～ 2.5 Å)。 繰り返しますが、これらの距離は 7 配位 DyIII の予想と一致しています (参考文献 7)。

アポタンパク質の蛍光の発光値は 1.0 に正規化されています。 Hans-LanM の Trp 残基の蛍光強度は RE 結合からアポ状態に移行すると減少するのに対し (補足​​図 30)、Mex の Tyr 残基の強度は RE 結合からアポ状態に移行すると増加することに注意してください 4,6。 初期条件: 全ての実験において、20 μM タンパク質、40 μM RE、20 mM 酢酸塩、100 mM KCl、pH 5.0。クエン酸塩の濃度を増加させて滴定した。 これらの条件下で各金属の50％が脱着されるクエン酸濃度（[クエン酸塩]1/2）を補足表11にまとめ、図4aにプロットします。 a、ハンス・ランM。 b、ハンス・ランM(R100K)。 Hans-LanM(R100K) と野生型 Hans-LanM における La と Nd の [クエン酸]1/2 値の圧縮された差は、LRE、特に LaIII に対する親和性の違いを高める際の二量体化の役割を示しています。 c、メキシコ-LanM。 Nd および Dy データは Dong ら 6 で報告されています。 d、各タンパク質のNdの[クエン酸]1/2値とDyの[クエン酸]1/2値の比の比較。Mex-LanMと比較してHans-LanMのNd/Dy選択性が高いことを示しています。 野生型 Hans-LanM と R100K バリアントの比率は、両側 t 検定によって有意な差はありません (p > 0.05)。これは、Arg100 が関与する水素結合ネットワークが NdIII/HRE 選択性に比較的わずかにしか寄与していないことを示唆しています。 LaIII の選択性に大きな影響を与えます (図 4a)。 すべてのデータは、3 つの独立した実験からのデータの平均 ± sd (a-c) または sem (d) として示されています。

ソースデータ

脱着スキームは、マロン酸塩の 3 段階の濃度 (30、50、90 mM; 右軸を参照) とそれに続く pH 1.5 の HCl で構成されました。 結果は、R100K変異体と比較して、Hans-LanMを使用するとわずかに低い純度のDyが生成されたことを明らかにしました（同様の収率で、それぞれ83.6％対98％のDy純度；図4dと比較）。 La-Dyを用いた平衡結合実験では、LaからGdまでの固定化タンパク質について同様の選択性プロファイルが観察されましたが、選択性パターンはTbで分岐しました（図4c）。 Hans-LanM と R100K バリアントの間の選択性の違いは、9 元素 RE グループにおける Dy の分配係数決定の不確実性により、Dy/Dy の小さな違いを区別する能力が妨げられたため、Nd/Dy バイナリ システムを使用して確認されました。タンパク質間の Nd 分離係数 (補足表 S13 ～ S14)。 このバイナリ Nd/Dy 実験 (拡張データ表 3) では、Hans-LanM の分離係数 8.12 ± 0.40、R100K バリアントの分離係数 12.7 ± 1.3 を決定しました。これは、R100K の Dy 分離効率の向上と一致しています。 9元素実験から得られた値と一致していますが、結果は遊離のHans-LanMおよびHans-LanM（R100K）タンパク質との平衡結合結果とはわずかに異なり、DyよりもNdに対する同様に高い選択性が明らかになりました（図4a） 、b）、おそらく、遊離タンパク質を用いた溶液実験の低タンパク質濃度（20μM）でのR100KバリアントにおけるLRE誘発二量体化の弱さを反映していると考えられます。 カラム上の La/Nd 選択性は、溶液中の遊離タンパク質 (野生型および R100K) の見かけの Kd 値で観察されたものとは異なりますが、遊離タンパク質を用いた実験では単一元素溶液と混合金属結合による影響が利用されている可能性があります。オンカラムデータに影響を与えます。 R100K バリアントは、RE:タンパク質の 2:1 化学量論比からも明らかなように、カラム上でより良好に動作します。 これらの結果について考えられる説明の 1 つは、固定化が二量体化を妨げることである可能性があります。 ただし、図2bはHans-LanM二量体のN末端とC末端を示しており、C末端が二量体界面の最も近い部分から約20Å離れていることを示しており、固定化自体が破壊するとは予想されないことを示唆しています。このインターフェース。 ただし、機能的二量体では 2 つの C 末端を近接して固定化する必要があることを考慮する必要がありますが、当社のカラムの固定化密度ではそのようなことは考えられません。 したがって、総合的に考えて、二量体化平衡はカラムに固定化された少数のタンパク質ユニットにのみ適用できるのではないかと考えられます。 カラム形式で二量体化平衡をより完全に活用すれば、さらに堅牢な分離が得られると考えられます。 カラム上で均一な二量体集団を得る最も確実な方法は、2 つの単量体を (ポリペプチド鎖などで) 結合し、単量体間相互作用に寄与する残基の突然変異誘発によって二量体化親和性を調整し、この二量体を固定化することであると考えられます。単一の取り付けポイント。 二量体化は他の分離形式でも利用できます。 これらの方向性が現在の取り組みの主題です。

ソースデータ

このファイルには、補足メソッド、補足図 1 ～ 31、補足表 1 ～ 16、および補足参考資料が含まれています。

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転載と許可

マトックス、JA、ユング、JJ、リン、CY。 他。 金属感受性ランモジュリンダイマーによる希土類分離の強化。 Nature 618、87–93 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-023-05945-5

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受信日: 2022 年 12 月 29 日

受理日: 2023 年 3 月 13 日

発行日: 2023 年 5 月 31 日

発行日: 2023 年 6 月 1 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05945-5

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